Produzione e caratterizzazione biochimica/funzionale della proteina Pin1 umana per l'identificazione di nuovi partner molecolari.

Pin1 is the only known peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) that specifically binds and isomerises the pSer/Thr-Pro motif, thereby mediating post-translational structural rearrangements that regulate the activity of a large number of target proteins. Pin1 is crucial in several cellular processes and its aberrant regulation leads to degenerative and neoplastic diseases. The role of Pin1 in the regulation of the cellular circadian clock is so far largely unexplored, despite the fact that many of its factors are targets for phosphorylation. The aim of the present study is to computationally search for the possible binding site of Pin1 in major components of the molecular clock and then to apply molecular biology techniques to verify the putative interaction in vitro. This project was motivated by the lack of studies on the role of PPIase Pin1 in regulating the cellular circadian clock. Using bioinformatics tools, a list of putative Pin1 target proteins was generated, which was taken as a starting point for the development of an in vitro setup to validate the correspondences found. Human recombinant Pin1 was expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS cells and purified by affinity chromatography. Recombinant Pin1 was then used as a 'decoy' protein in a pull-down assay, in which immobilised Pin1 was incubated with Caco2 tumour cell extract. The NFE2-like transcription factor bZIP 2 (NRF2) was chosen from the list of candidate proteins obtained from the computational analysis for further analysis in Western blot; unfortunately, we could not find NRF2 among the proteins pulled down with Pin1.

Pin1 è l'unica peptidil-prolil cis-trans isomerasi (PPIasi) nota che lega e isomerizza specificamente il motivo pSer/Thr-Pro, mediando così riarrangiamenti strutturali post-traslazionali che regolano l'attività di un gran numero di proteine bersaglio. Pin1 è fondamentale in diversi processi cellulari e la sua regolazione aberrante porta a malattie degenerative e neoplastiche. Il ruolo di Pin1 nella regolazione dell'orologio circadiano cellulare è finora in gran parte inesplorato, nonostante molti dei suoi fattori siano bersagli di fosforilazione. Lo scopo del presente studio è quello di ricercare computazionalmente il possibile sito di legame di Pin1 nei principali componenti dell'orologio molecolare e quindi di applicare tecniche di biologia molecolare per verificare la putativa interazione in vitro. Questo progetto è stato motivato dalla mancanza di studi sul ruolo della PPIasi Pin1 nella regolazione dell'orologio circadiano cellulare. Utilizzando strumenti bioinformatici, è stato generato un elenco di proteine bersaglio putative di Pin1, che è stato preso come punto di partenza per lo sviluppo di un setup in vitro per convalidare le corrispondenze trovate. La Pin1 ricombinante umana è stata espressa in cellule E. coli BL21 (DE3) pLysS e purificata mediante cromatografia di affinità. La Pin1 ricombinante è stata poi utilizzata come proteina "esca" in un saggio di pull-down, in cui la Pin1 immobilizzata è stata incubata con l'estratto cellulare di cellule tumorali Caco2. Il fattore di trascrizione bZIP 2 (NRF2), simile a NFE2, è stato scelto dall'elenco delle proteine candidate ottenute dall'analisi computazionale per un'ulteriore analisi in Western Blot; purtroppo, non siamo riusciti a trovare NRF2 tra le proteine tirate giù con Pin1.