Produzione di proteine ricombinanti di SARS-CoV-2 e analisi strutturale mediante tecniche SAXS

Il Coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) è l'agente eziologico della malattia responsabile della pandemia di COVID-19, finora priva di trattamento efficace. La scoperta di agenti terapeutici per il trattamento del COVID-19 è urgente e in questo contesto, lo studio delle strutture delle proteine virali, potenziali bersagli di farmaci durante il ciclo di vita virale, è di fondamentale importanza. Le proteasi Mpro svolgono un ruolo essenziale nel processo di replicazione virale. Esse sono in grado di scindere le poliproteine virali in più siti, per produrre diverse proteine funzionali, e sono considerate come obiettivi chiave per la prevenzione e il trattamento dell’infezione. In particolare, poiché l'unità funzionale di Mpro è un omodimero, la conoscenza dettagliata dell’equilibrio monomero-dimero risulta essenziale per possibili interventi terapeutici. La proteina nucleocapsidica (N) di SARS-CoV-2 lega un genoma di RNA virale a filamento singolo per formare un complesso ribonucleoproteico elicoidale che viene impacchettato in particelle di virione. A causa della conservazione della sua sequenza proteica nella maggior parte dei β-Coronavirus e della sua elevata immunogenicità, la proteina N viene scelta come strumento diagnostico o come potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi vaccini. Gli obiettivi di questo lavoro di tesi riguardano: la produzione per via ricombinante di Mpro e la verifica delle sue proprietà funzionali e strutturali; la produzione per via ricombinante della proteina N al fine di determinare le più idonee condizioni di coltura e purificazione. La produzione delle proteine ricombinanti ha previsto l’utilizzo del ceppo di E. Coli denominato BL21 (DE3) pLysS, che è servito come sistema “ospite” per l’inserimento dei vettori di espressione plasmidici contenenti la porzione di DNA codificante per entrambe le proteine ricombinanti. In entrambi i sistemi, l’espressione della proteina è stata indotta mediante aggiunta di IPTG al terreno di coltura. Successivamente, gli estratti proteici totali sono stati sottoposti a purificazione mediante cromatografia IMAC ed è stata determinata la resa finale del processo. Gli studi SAXS eseguiti su Mpro, hanno permesso di studiare le caratteristiche strutturali di SARS-CoV-2 Mpro in soluzione in funzione della concentrazione proteica e della temperatura ed hanno evidenziato che poiché la forma funzionale di Mpro è un dimero, i composti che interrompono la dimerizzazione possono essere efficaci nel diminuire la sua attività catalitica.