Ottimizzazione della trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens per il gene FveFT2 in due varietà di mora

Since many years the primocane-fruiting is one of the most innovative and difficult traits in the blueberry selection, indeed, the selection is complicated because of many factors, like: the polyploidy, the high level of heterozygosity in this species, the lack of genetic diversity in cultivar d’èlite and the lack of natural donors. A promising alternative to overcome these issues is the transfer of the genes of interest by using Agrobacterium tumefaciens. In the following thesis, experimental trials have been conducted with the goal of optimizing the A. tumefaciens-mediated genetic transformation for the trait responsible for the reflowering in strawberries (FveFT2) in two blackberry cultivars of commercial interest, ‘Loch Ness’ and ‘Loch Tay’. One of the main obstacles to the genetic transformation of the blackberry, via A. tumefaciens, is represented by the use of a correct regeneration system of the transformed cells. The regeneration protocols for blackberry plants are often genotype-specific because of the high genetic variability present in this species; in addition, the efficiency of the in vitro regeneration of the transformed cells is influenced by the presence of antibiotics in the selection/regeneration culture media, to which the species turns out to be sensitive. The experimental work conducted is dedicated to the optimization of the selection/regeneration culture media of the two cultivars in object, subsequently used for a trial of an A. tumefaciens-mediated genetic transformation, and to the identification of a genotype and a type of initial explant less recalcitrant to transformation. The protocols developed by this thesis will be used to continue to take trials of transformation with Agrobacterium, aimed at obtaining a minimum number of genetically transformed lines, useful to experiment the effect of the inserted gene on the uniferous habitus of the variety of blackberries under study.

Da diversi anni la rifiorenza è uno dei caratteri più innovativi e più difficili nella selezione delle more, infatti, la selezione risulta complicata a causa di numerosi fattori, quali: la poliploidia, l’alto livello di eterozigosi presente nelle specie, la mancanza di diversità genetica in cultivar d’élite e la mancanza di donatori naturali. Un’alternativa promettente per superare questi vincoli è il trasferimento dei geni di interesse mediante l'uso di Agrobacterium tumefaciens. Nella seguente tesi sono state condotte diverse prove sperimentali che hanno avuto l’obiettivo di ottimizzare la trasformazione genetica mediata da A. tumefaciens per il carattere responsabile della rifiorenza in fragola (FveFT2) in due cultivar di mora di interesse commerciale, ‘Loch Ness’ e ‘Loch Tay’. Uno dei principali ostacoli alla trasformazione genetica della mora, mediante A. tumefaciens, è rappresentato dall’utilizzo di un corretto sistema di rigenerazione delle cellule trasformate. I protocolli di rigenerazione per le piante di mora sono spesso genotipo specifici a causa dell’elevata variabilità genetica presente nella specie; inoltre, l’efficienza di rigenerazione in vitro delle cellule trasformate è influenzata dalla presenza di antibiotici all’interno dei terreni di selezione/rigenerazione, ai quali la specie risulta sensibile. Il lavoro sperimentale svolto è dedicato all’ottimizzazione dei terreni di selezione/rigenerazione delle due cultivar oggetto di studio, successivamente utilizzati per una prova di trasformazione genetica mediata da A. tumefaciens, e all’individuazione di un genotipo e di una tipologia di espianto iniziale meno recalcitranti alla trasformazione. I protocolli sviluppati da questa tesi serviranno per continuare ad effettuare prove di trasformazione con Agrobacterium con l’obiettivo di ottenere un numero minimo di linee geneticamente trasformate, utili per sperimentare l’effetto del gene inserito sull’habitus unifero delle varietà di mora oggetto di studio.