Ottimizzazione della metodica Comet assay su diverse linee cellulari

The comet assay, also known as single-cell gel electrophoresis, is a sensitive and widely used technique for detecting DNA damage at the single-cell level. This method offers numerous advantages, including the ability to directly examine the portion of DNA resulting from strand breaks in individual cells, making it a valuable tool for genotoxicity and biomonitoring studies. Oxidative stress is a pathological condition caused by an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and the body's antioxidant defenses. This imbalance can lead to significant damage to cellular macromolecules, including lipids, proteins, and nucleic acids, and has been associated with the pathogenesis of many chronic diseases such as neurodegenerative disorders, cardiovascular diseases, autoimmune conditions, and cancer. Developing and optimizing a standardized protocol for the comet assay that is adaptable to different cell lines, in order to accurately and reproducibly measure DNA damage induced by oxidative stress, is increasingly demanded by the scientific community and it was the goal of this thesis. To achieve this, the protocol was tested on human lymphocytes, the immortalized cell line Human Hepatocellular Carcinoma G2 (HepG2), and primary fibroblasts isolated from gingival biopsies of patients with Rett syndrome. These cell lines were chosen to represent a variety of human cell types and for their relevance in clinical and research studies. The optimization of the protocol has yielded promising results, demonstrating the robustness and reproducibility of the protocol itself.

Il comet assay, noto anche come elettroforesi su gel a singola cellula, è una tecnica sensibile e ampiamente utilizzata per rilevare il danno al DNA a livello di singola cellula. Questo metodo offre numerosi vantaggi, tra cui la capacità di esaminare direttamente la porzione di DNA risultante dalla rottura del filamento nelle singole cellule, rendendolo uno strumento prezioso per studi di genotossicità e biomonitoraggio. Lo stress ossidativo è una condizione patologica causata da uno squilibrio tra la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e le difese antiossidanti dell'organismo. Questo squilibrio può portare a danni significativi alle macromolecole cellulari, inclusi lipidi, proteine e acidi nucleici, ed è stato associato alla patogenesi di molte malattie croniche come disturbi neurodegenerativi, malattie cardiovascolari, condizioni autoimmuni e cancro. Sviluppare e ottimizzare un protocollo standardizzato per il comet assay che sia adattabile a diverse linee cellulari, al fine di misurare in modo accurato e riproducibile il danno al DNA indotto dallo stress ossidativo è sempre più richiesto dalla comunità scientifica ed è stato l'obiettivo della tesi. Per fare ciò il protocollo è stato testato su linfociti umani, sulla linea cellulare immortalizzata Human Hepatocellular Carcinoma G2 (HepG2) e sui fibroblasti primari isolati da biopsie gengivali di pazienti affetti dalla sindrome di Rett. Queste linee cellulari sono state scelte per rappresentare una varietà di tipi cellulari umani e per la loro rilevanza in studi clinici e di ricerca. L'ottimizzazione del protocollo ha portato a risultati promettenti, dimostrando la robustezza e la riproducibilità del protocollo stesso.