Naïve induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a crucial resource for research, sharing key molecular and epigenetic features with the pre-implantation epiblast and possessing the ability to differentiate into all adult tissues. However, the transient nature of naïve identity in vivo, alongside ethical and technical constraints, complicates its characterization and study. Capturing this stage in vitro is essential for uncovering the mechanisms governing early embryogenesis, which remain largely unexplored. Existing protocols for generating human naïve iPSCs often suffer from low efficiency, high mutagenesis and tumorigenicity rates, and significant resource demands, complicating large-scale studies involving patient-derived cell lines. To overcome these limitations, we developed a novel approach for generating human naïve iPSCs by directly reprogramming human dermal fibroblasts (HDF) using a microfluidic system. Our results demonstrated the derivation of naïve iPSCs: notably, our system achieved signs of mesenchymal-to-epithelial transition (MET) as early as day four, with definitive naïve markers emerging by day 12, while displaying colony formation. Immunofluorescence analyses confirmed the expected expression of pluripotency markers, including KLF17, indicating naïve identity, alongside GATA3, a trophoblast stem cell marker. This suggests a novel interplay between naïve and trophoblast stem cells, which could play a role in creating a supportive microenvironment for naïve iPSC formation. We further demonstrated the versatility of our approach by reprogramming fibroblasts from patients with Fragile X syndrome, obtaining naïve colonies with similar characteristics to control conditions. Additionally, we explored inducing trophoblast stem cells directly from fibroblasts, achieving significant morphological and molecular changes. To refine our protocol and improve naïve pluripotency maintenance, we examined various signaling pathways that regulate pluripotency, including the Hippo and Wnt-β-catenin. In summary, our microfluidic-based direct reprogramming method represents a rapid and cost-effective strategy for generating genetically stable and developmentally competent naïve iPSCs. These cells are being utilized to create organoids for modeling neurodevelopmental disorders like Fragile X syndrome, paving the way for personalized therapies. Ongoing investigations, including single-cell RNA sequencing, continue to characterize the naïve iPSCs, revealing insights into their potential for generating blastoids and understanding embryonic development.

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) in stato naïve rappresentano una risorsa fondamentale per la ricerca, condividendo caratteristiche molecolari ed epigenetiche chiave con l’epiblasto in fase di pre-impianto e possedendo la capacità di differenziarsi in tutti i tessuti adulti. Tuttavia, la natura transitoria dello stato naïve in vivo, unita a limitazioni etiche e tecniche, ne rende complessi lo studio e la caratterizzazione. Riprodurre questa fase in vitro è essenziale per scoprire i meccanismi che regolano le prime fasi dell'embriogenesi, ancora in gran parte inesplorati. I protocolli attuali per generare iPSCs naïve umane soffrono spesso di bassa efficienza, alti tassi di mutagenesi e tumori e richiedono notevoli risorse, ostacolando studi su larga scala con linee cellulari derivate da pazienti. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un approccio innovativo per generare iPSCs naïve umane attraverso la riprogrammazione diretta dei fibroblasti dermici umani (HDF) utilizzando un sistema microfluidico. I nostri risultati mostrano la derivazione di iPSCs naïve: il nostro sistema ha evidenziato segni di transizione mesenchimale-epiteliale (MET) già al quarto giorno, con l’emergere di marcatori naïve definitivi al giorno 12 e la formazione di colonie. Le analisi di immunofluorescenza hanno confermato l’espressione prevista di marcatori di pluripotenza, come KLF17, indicativo di identità naïve, insieme a GATA3, un marcatore di cellule staminali trofoblastiche. Questo suggerisce un’interazione inedita tra cellule staminali naïve e trofoblastiche, che potrebbe contribuire alla creazione di un microambiente favorevole alla formazione delle iPSCs naïve. Abbiamo inoltre dimostrato la versatilità del nostro approccio riprogrammando fibroblasti di pazienti affetti dalla sindrome dell’X fragile, ottenendo colonie naïve con caratteristiche simili alle condizioni di controllo. Abbiamo esplorato anche la possibilità di indurre direttamente cellule staminali trofoblastiche dai fibroblasti, ottenendo rilevanti cambiamenti morfologici e molecolari. Per perfezionare il nostro protocollo e migliorare il mantenimento della pluripotenza naïve, abbiamo esaminato diverse vie di segnalazione che regolano la pluripotenza, tra cui Hippo e Wnt-β-catenina. In sintesi, il nostro metodo di riprogrammazione diretta basato su sistema microfluidico rappresenta una strategia rapida e conveniente per generare iPSCs naïve geneticamente stabili e competenti sul piano dello sviluppo. Queste cellule vengono utilizzate per creare organoidi destinati a modelli di disturbi neuroevolutivi, come la sindrome dell’X fragile, aprendo la strada a terapie personalizzate. Le indagini in corso, inclusa la sequenziamento di RNA- single cell, continuano a caratterizzare le iPSCs naïve, svelandone il potenziale nella generazione di blastoidi e nella comprensione dello sviluppo embrionale.

SVILUPPO DI UNA TECNICA DI REPROGRAMMING PER DERIVARE NAΪVE iPSCs UMANE DA FIBROBLASTI UMANI

TREVISAN, FRANCESCA
2023/2024

Abstract

Naïve induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a crucial resource for research, sharing key molecular and epigenetic features with the pre-implantation epiblast and possessing the ability to differentiate into all adult tissues. However, the transient nature of naïve identity in vivo, alongside ethical and technical constraints, complicates its characterization and study. Capturing this stage in vitro is essential for uncovering the mechanisms governing early embryogenesis, which remain largely unexplored. Existing protocols for generating human naïve iPSCs often suffer from low efficiency, high mutagenesis and tumorigenicity rates, and significant resource demands, complicating large-scale studies involving patient-derived cell lines. To overcome these limitations, we developed a novel approach for generating human naïve iPSCs by directly reprogramming human dermal fibroblasts (HDF) using a microfluidic system. Our results demonstrated the derivation of naïve iPSCs: notably, our system achieved signs of mesenchymal-to-epithelial transition (MET) as early as day four, with definitive naïve markers emerging by day 12, while displaying colony formation. Immunofluorescence analyses confirmed the expected expression of pluripotency markers, including KLF17, indicating naïve identity, alongside GATA3, a trophoblast stem cell marker. This suggests a novel interplay between naïve and trophoblast stem cells, which could play a role in creating a supportive microenvironment for naïve iPSC formation. We further demonstrated the versatility of our approach by reprogramming fibroblasts from patients with Fragile X syndrome, obtaining naïve colonies with similar characteristics to control conditions. Additionally, we explored inducing trophoblast stem cells directly from fibroblasts, achieving significant morphological and molecular changes. To refine our protocol and improve naïve pluripotency maintenance, we examined various signaling pathways that regulate pluripotency, including the Hippo and Wnt-β-catenin. In summary, our microfluidic-based direct reprogramming method represents a rapid and cost-effective strategy for generating genetically stable and developmentally competent naïve iPSCs. These cells are being utilized to create organoids for modeling neurodevelopmental disorders like Fragile X syndrome, paving the way for personalized therapies. Ongoing investigations, including single-cell RNA sequencing, continue to characterize the naïve iPSCs, revealing insights into their potential for generating blastoids and understanding embryonic development.
2023
2024-10-24
DEVELOPMENT OF A REPROGRAMMING TECHNIQUE FOR THE DERIVATION OF HUMAN NAΪVE iPSCs FROM HUMAN FIBROBLASTS
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) in stato naïve rappresentano una risorsa fondamentale per la ricerca, condividendo caratteristiche molecolari ed epigenetiche chiave con l’epiblasto in fase di pre-impianto e possedendo la capacità di differenziarsi in tutti i tessuti adulti. Tuttavia, la natura transitoria dello stato naïve in vivo, unita a limitazioni etiche e tecniche, ne rende complessi lo studio e la caratterizzazione. Riprodurre questa fase in vitro è essenziale per scoprire i meccanismi che regolano le prime fasi dell'embriogenesi, ancora in gran parte inesplorati. I protocolli attuali per generare iPSCs naïve umane soffrono spesso di bassa efficienza, alti tassi di mutagenesi e tumori e richiedono notevoli risorse, ostacolando studi su larga scala con linee cellulari derivate da pazienti. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un approccio innovativo per generare iPSCs naïve umane attraverso la riprogrammazione diretta dei fibroblasti dermici umani (HDF) utilizzando un sistema microfluidico. I nostri risultati mostrano la derivazione di iPSCs naïve: il nostro sistema ha evidenziato segni di transizione mesenchimale-epiteliale (MET) già al quarto giorno, con l’emergere di marcatori naïve definitivi al giorno 12 e la formazione di colonie. Le analisi di immunofluorescenza hanno confermato l’espressione prevista di marcatori di pluripotenza, come KLF17, indicativo di identità naïve, insieme a GATA3, un marcatore di cellule staminali trofoblastiche. Questo suggerisce un’interazione inedita tra cellule staminali naïve e trofoblastiche, che potrebbe contribuire alla creazione di un microambiente favorevole alla formazione delle iPSCs naïve. Abbiamo inoltre dimostrato la versatilità del nostro approccio riprogrammando fibroblasti di pazienti affetti dalla sindrome dell’X fragile, ottenendo colonie naïve con caratteristiche simili alle condizioni di controllo. Abbiamo esplorato anche la possibilità di indurre direttamente cellule staminali trofoblastiche dai fibroblasti, ottenendo rilevanti cambiamenti morfologici e molecolari. Per perfezionare il nostro protocollo e migliorare il mantenimento della pluripotenza naïve, abbiamo esaminato diverse vie di segnalazione che regolano la pluripotenza, tra cui Hippo e Wnt-β-catenina. In sintesi, il nostro metodo di riprogrammazione diretta basato su sistema microfluidico rappresenta una strategia rapida e conveniente per generare iPSCs naïve geneticamente stabili e competenti sul piano dello sviluppo. Queste cellule vengono utilizzate per creare organoidi destinati a modelli di disturbi neuroevolutivi, come la sindrome dell’X fragile, aprendo la strada a terapie personalizzate. Le indagini in corso, inclusa la sequenziamento di RNA- single cell, continuano a caratterizzare le iPSCs naïve, svelandone il potenziale nella generazione di blastoidi e nella comprensione dello sviluppo embrionale.
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