Sviluppo di una barriera intestinale quale modulo di una piattaforma in vitro 3D per lo studio dell’interazione tra microbiota intestinale e tessuto osseo

The intestinal barrier plays a crucial role in maintaining homeostasis between the body and the external environment, regulating the selective passage of nutrients and protecting against pathogens. The mechanisms underlying this role require further investigation. With this in mind, and following the principles of the 3Rs (Replacement, Reduction and Refinement), we set out to develop an in vitro system capable of mimicking the intestinal barrier. In collaboration with the 'E. Piaggio' Research Centre of the University of Pisa, an electrospun gelatin scaffold was developed that mimicked the native extracellular matrix (ECM) and provided an optimal three-dimensional environment for epithelial cell growth. The Caco-2 cell line was used to develop the intestinal epithelium. These cells were grown on electrospun membranes and on a control Transwell system. The formation of a cell monolayer with morphological characteristics similar to those of the small intestinal epithelium was observed, with the presence of tight junctions, adherens junctions, orbital layers and goblet cells. Furthermore, functional studies using Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER) measurements and Lucifer Yellow permeability assays demonstrated the ability of the developed system to mimic the selective permeability of the intestinal epithelium. Furthermore, in order to validate the system and given the importance of the gut microbiota in mediating the interactions of the gut with different anatomical regions of the body, we wanted to evaluate the possible interference of a supernatant obtained from healthy subjects on the morphology and functionality of the developed epithelium. The results obtained are encouraging and the use of biofabricated scaffolds is a promising approach for the development of 3D in vitro models to study gut-organ crosstalk, responding to the growing need to reduce animal experimentation in line with the 3Rs.

La barriera intestinale svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi tra l'organismo e l'ambiente esterno, regolando il passaggio selettivo dei nutrienti e proteggendolo dagli agenti patogeni. I meccanismi alla base di tale ruolo necessitano ancora approfondimenti. In quest’ottica e seguendo i principi delle 3R (Replacement, Reduction, and Refinement), si è voluto sviluppare un sistema in vitro che fosse in grado di mimare la barriera intestinale. In collaborazione con il Centro di Ricerca “E. Piaggio” dell’Università di Pisa stata sviluppata un'impalcatura di gelatina elettrofilata che imitasse la matrice extracellulare (ECM) nativa e fornisse un ambiente tridimensionale ottimale per la crescita di cellule epiteliali Per lo sviluppo dell’epitelio intestinale è stata utilizzata la linea cellulare Caco-2. Tali cellule sono state coltivate sulle membrane elettrofilate e su un sistema Transwell di controllo. Si è osservata la formazione di un monostrato cellulare con caratteristiche morfologiche riconducibili a quelle dell’epitelio dell'intestino tenue, con la presenza di tight junction, giunzioni aderenti, orletto strato e cellule mucipare caliciformi. Inoltre studi funzionali attraverso misurazioni della resistenza elettrica trans-epiteliale (TEER) e saggi di permeabilità con Lucifer Yellow hanno evidenziato la capacità del sistema sviluppato di imitare la permeabilità selettiva dell'epitelio intestinale. Inoltre, per validare il sistema e data l’importanza del microbiota intestinale nel mediare le interazioni dell’intestino con i diversi distretti anatomici dell’organismo, si è voluto valutare la possibile interferenza di un surnatante ottenuto da soggetti sani sulla morfologia e sulla funzionalità dell'epitelio sviluppato. I risultati ottenuti sono incoraggianti e l'uso di scaffold biofabbricati risulta un approccio promettente per lo sviluppo di modelli 3D in vitro per studiare il crosstalk intestino-organi, rispondendo alla crescente necessità di ridurre la sperimentazione animale aderendo al principio delle 3Rs.