Valutazione della funzione di barriera degli strands di Claudina-5 nella barriera emato-encefalica attraverso simulazione di Dinamica Molecolare

In the blood-brain barrier (BBB), the endothelial cells are joined together by multi-protein assemblies named tight junctions (TJs), able to seal the paracellular space between them, preventing the passage of substances. Claudin-5 (Cldn5) is the most abundant in the BBB TJs among these proteins. Despite growing interest as a potential pharmacological target, how Cldn5 monomers assemble to form TJs remains poorly understood. Structural models for complexes of Cldn5 and other claudins have been proposed and assessed via computational and experimental approaches. In these models, first introduced for channel-forming, selectively permeable claudins, the protomers are arranged to form pores in the paracellular space. Lately, it has been suggested that barrier-forming Cldn might adopt the same architectures, with the barrier function arising from electrostatic and/or steric effects ascribed to the pore-lining residues. With limited exceptions, however, previous computational studies focused on oligomers of only a few subunits, whereas extended polymeric Cldn strands form TJs. Here, we employed standard molecular dynamics (MD) simulation and free energy (FE) calculation to study a model of a TJ-forming Cldn5 complex containing three pores in the paracellular space, referred to as Multi-Pore I. We simulated the system under two different restraint setups to assess the stability of the structure and the central pore, measuring the pore radius to evaluate the system’s dynamics and two crucial residues in the paracellular pore. These reveal that Multi-Pore I with both the restraint setups are stable, considering the overall structure and the central pore, and suggest the impact of adjacent pores on the size of the central cavity. The FE calculation of ions permeation across the central pore showed that the system's barrier properties for anions and cations do not align with experimental observations. The barrier is evident for the cation, but the anion's FE values are too low to consider a real energetic barrier. Despite these limitations, our work offers new insights into the Cldn5 structure. Although further evaluation of its functional aspects is necessary, this work is a foundation for future investigations. The final goal of studying this complex architecture is to introduce a baseline model of BBB TJs, which may be useful in exploring barrier dysfunction in neurodegenerative disorders and the development of therapeutic approaches.

La tesi si concentra sullo studio della struttura e sulla funzionalità delle tight junctions (TJs) nel sistema nervoso centrale, con particolare attenzione alla Claudina-5 (Cldn5), una proteina chiave nella barriera emato-encefalica (BBB). L'obiettivo principale è stato studiare un modello complesso di TJs denominato Multi-Poro I, composto da più pori paracellulari, utilizzando simulazioni di dinamica molecolare (MD) e calcoli di energia libera (FE). L'intento è stato comprendere meglio la struttura e le proprietà di barriera della Cldn5, con possibili implicazioni nello studio delle disfunzioni della BBB e nello sviluppo di terapie per malattie neurodegenerative. Le simulazioni, in NPT per entrambi i sistemi, hanno valutato il comportamento del sistema Multi-Poro I in due configurazioni distinte: una con un setup di vincoli estesi (restrizioni posizionali su più residui) e un'altra con vincoli limitati. Entrambe le configurazioni hanno dimostrato stabilità complessiva della struttura, ma con differenze significative nella dinamica dei pori e nella flessibilità strutturale. I risultati delle analisi RMSD (Root Mean Square Deviation) hanno mostrato che il sistema con vincoli estesi raggiunge rapidamente un equilibrio dinamico, con fluttuazioni minime (inferiori a 2 Å), evidenziando una maggiore stabilità. Al contrario, nel sistema con vincoli limitati, l’RMSD è aumentato più significativamente durante i primi 100 ns di simulazione, stabilizzandosi intorno a 6-7 Å dopo circa 400 ns. Questo comportamento riflette una maggiore flessibilità strutturale, in particolare nelle regioni periferiche dei pori. L'analisi delle cross-distances (CDs) ha fornito ulteriori dettagli sulla stabilità dei pori, concentrandosi su specifici residui chiave come Q57, Q63, V70 e V154. I residui all'interno del poro centrale (Q57 e Q63) hanno mostrato stabilità elevata in entrambi i setup, indicando che l'architettura centrale della β-barrel è robusta. Tuttavia, all’esterno del poro (V70 e V154), sono state osservate maggiori fluttuazioni nel setup con vincoli limitati, suggerendo una maggiore dinamicità nelle regioni periferiche ma comunque confermando la stabilità in simulazione del β-barrel. L'analisi dei raggi dei pori ha rivelato che il profilo del raggio presenta la tipica forma a clessidra, con restringimenti significativi nella regione centrale, in corrispondenza del residuo Q57. Nel sistema con vincoli estesi, il raggio minimo è stato di circa 2,5 Å, mentre nel setup con vincoli limitati il raggio è risultato leggermente più ampio (~4 Å) e più variabile, evidenziando una struttura meno rigida. Dal punto di vista funzionale, i profili di FE calcolati per la permeazione degli ioni Na⁺ e Cl⁻ attraverso il poro centrale hanno mostrato differenze significative. Per il Na⁺, è stato osservato un picco energetico di circa 6 kcal/mol nella regione centrale, che rappresenta una barriera significativa alla permeazione. Questo risultato è coerente con il restringimento osservato nel profilo del raggio e conferma la funzione di barriera del sistema per i cationi. Al contrario, il profilo del Cl⁻ ha mostrato oscillazioni energetiche più marcate, con valori che variano da -2 a +1.5 kcal/mol nella regione centrale. Questo suggerisce che il sistema Multi-Poro I non fornisce una barriera energetica altrettanto efficace per gli anioni, contrariamente alle osservazioni sperimentali. In conclusione, la tesi fornisce un modello strutturale e funzionale dettagliato delle TJs formate dalla Cldn5, evidenziando sia i limiti che le potenzialità del sistema Multi-Poro I. Sebbene i risultati non siano completamente coerenti con le osservazioni sperimentali (in particolare per quanto riguarda la barriera agli anioni), il lavoro rappresenta un punto di partenza per studi futuri sulle disfunzioni della BBB e sullo sviluppo di approcci terapeutici mirati.