Ruolo dei fattori di trascrizione FOXO nella tolleranza al congelamento dell’intero corpo nella rana di legno, Rana sylvatica

To survive total freezing during winter, Lithobates sylvaticus (the wood frog) employs various strategies to conserve energy: prioritization of energy sources and depression of metabolic rate, both through the transcription of specific genes. When the wood frog freezes, oxidative phosphorylation and metabolic flow are suspended. To reach this state, most non-essential ATP-consuming metabolic processes are strongly suppressed, reducing to just 1–5% of normal activity. Since the most energy-demanding processes include cell proliferation and metabolic regulation, FOXO transcription factors are particularly relevant, as they are responsible for managing precisely these processes. The Forkhead family includes over 100 transcription factors involved in many cellular functions. These factors are divided into 19 subclasses (A–S), among which FOXO (Forkhead Other) are the only ones regulated through the PKB/Akt pathway. These kinases, when active, phosphorylate FOXO proteins, causing their translocation from the nucleus to the cytosol, thereby inactivating them. During the experiment, male frogs were collected, and samples from heart, brain, liver, and kidneys were subsequently obtained. Using Western blot analysis, the levels of phosphorylated (inactive) and non-phosphorylated (active) FOXO1 and FOXO3 were examined. The results show that during freezing, the phosphorylated inactive forms of FOXO1 and FOXO3 decrease in the tissues, suggesting an increase in their activity. This is reflected in an upregulation of protective gene transcription (e.g., MnSOD and catalase) and a halt in the cell cycle, both necessary to conserve energy. Additionally, FOXO1 activates genes involved in gluconeogenesis, promoting the production of glucose as a cryoprotectant. Studying the main genes involved in the freezing response of Lithobates sylvaticus enables the development of efficient solutions applicable to human organ cryopreservation. Moreover, the discovery of the link between FOXO and oxidative damage regulation opens future perspectives for including antioxidants in cryopreservation strategies.

Per sopravvivere al congelamento totale durante l’inverno, Lithobates sylvaticus utilizza diverse strategie per risparmiare energia: priorizzazione delle fonti energetiche e depressione del tasso metabolico, entrambe mediante la trascrizione di determinati geni. Quando la rana di legno congela, la fosforilazione ossidativa e il flusso metabolico vengono sospesi. Per raggiungere questo stato, la maggior parte dei processi metabolici non essenziali che consumano ATP viene fortemente soppressa, riducendosi all'1–5% del normale. Poiché i processi più dispendiosi in termini energetici includono la proliferazione cellulare e la regolazione metabolica, i fattori di trascrizione FOXO risultano particolarmente rilevanti dal momento che si occupano di amministrare proprio questi processi. La famiglia Forkhead comprende oltre 100 fattori di trascrizione, coinvolti in molte funzioni cellulari. Questi fattori sono suddivisi in 19 sottoclassi (A-S), tra le quali i FOXO (Forkhead other) sono gli unici regolati tramite il pathway PKB/Akt, delle chinasi che se attive, fosforilano i FOXO facendoli traslocare dal nucleo al citosol, inattivandoli. Durante l’esperimento si sono prelevate rane maschio da cui in seguito sono stati ricavati i campioni di cuore, cervello, fegato e reni. Attraverso il Western blot si sono controllati i livelli di FOXO1 e FOXO3 fosforilati (inattivi) e non fosforilati (attivi). Dai risultati emerge che durante il congelamento diminuiscono le forme fosforilate inattive di FOXO1 e FOXO3 nei tessuti, suggerendo un loro aumento di attività. Ciò si riflette in una maggiore trascrizione di geni protettivi (es. MnSOD e catalasi) e in un arresto del ciclo cellulare, necessari per conservare energia. FOXO1, inoltre, attiva i geni della gluconeogenesi, favorendo la produzione di glucosio come crioprotettore. Lo studio dei geni principali coinvolti nella risposta al congelamento in Lithobates sylvaticus, permette di trovare risposte efficienti applicabili al contesto umano nell’ambito della crioconservazione degli organi. Inoltre la scoperta del legame tra FOXO e regolazione del danno ossidativo apre prospettive future sull’inclusione degli antiossidanti nella crioconservazione.