Studio computazionale di una variante patogena che induce l'inattivazione della corrente in un canale del potassio non inattivante.

In the central nervous system (CNS), Kv7 subunits, encoded by the KCNQ gene family, assemble into voltage-dependent potassium (K+) channels, fundamental proteins involved in regulating neuronal excitability, the resting membrane potential (RMP), and various other processes. Among this family of proteins, the Kv7.2 is one of the most important and widely distributed potassium channels of the Kv7 family across the CNS. Mutations for this protein are frequently associated with neonatal epilepsies and can alter its function through loss-of-function mechanisms. However, despite their clinical relevance, only a small fraction of all known mutations in these proteins have been studied and characterized, using either computational or experimental approaches. In this work, we employed molecular dynamics (MD) simulations to characterize the structural consequences of the Kv7.2 A265V mutation, located in the P-loop in the transmembrane domain, and experimentally shown to induce inactivation in the otherwise non-inactivating channel. We conducted extended, multiple-replica simulations of different protein models varying in domain composition (only pore domain or pore and voltage sensor domains) and lipidic co-factors, embedded in solvated bilayers, and analyzed specific structural parameters to identify potential instabilities of the structures. Our data reveal that, when the whole transmembrane protein model bound with the co-factor PIP2 is considered, the mutation induces a significant structural instability and loss of inter-subunit symmetry at the level of the selectivity filter, potentially affecting ion conduction. Analysis of residue-residue interactions revealed the involvement of key amino acids from adjacent chains of the pore and voltage sensor domains. Based on these observations, the proposed mechanism for mutation-induced current inactivation involves the strengthening of a hydrophobic cluster involving the mutated residue and W288, which generates local tension in the protein chain. This tension propagates to the filter region, where it disrupts a π-stacking interaction between conserved tyrosine residues, a contact well known to play a pivotal role in stabilizing the selectivity filter of potassium channels. Overall, these findings represent a first step toward the atomistic characterization of current inactivation, which appears to differ from previously described inactivation pathways, as a novel pathogenetic mechanism in KCNQ2-DEE caused by the A265V mutation, which is essential for understanding disease pathophysiology and guiding pharmacological intervention strategies.

Nel sistema nervoso centrale (CNS), le subunità Kv7, codificate dalla famiglia genica KCNQ, si assemblano in canali del potassio (K⁺) voltaggio-dipendenti, proteine fondamentali coinvolte nella regolazione dell’eccitabilità neuronale, del potenziale di membrana a riposo (RMP) e di numerosi altri processi. All’interno di questa famiglia, Kv7.2 rappresenta uno dei canali del potassio più importanti e ampiamente distribuiti nel sistema nervoso centrale. Le mutazioni di questa proteina sono frequentemente associate a forme di epilessia neonatale e possono alterarne la funzione attraverso meccanismi di perdita di funzione (*loss-of-function*). Tuttavia, nonostante la loro rilevanza clinica, solo una piccola parte delle mutazioni note in queste proteine è stata finora studiata e caratterizzata, sia con approcci computazionali che sperimentali. In questo lavoro, abbiamo impiegato simulazioni di dinamica molecolare (MD) per caratterizzare le conseguenze strutturali della mutazione A265V della Kv7.2, localizzata nel P-loop del dominio transmembrana, e sperimentalmente dimostrata capace di indurre inattivazione in un canale altrimenti non inattivante. Sono state condotte simulazioni prolungate e su più repliche di diversi modelli proteici, variando la composizione dei domini (solo dominio del poro oppure poro e dominio sensore di voltaggio) e la presenza di cofattori lipidici, tutti inseriti in bilayer solvato. L’analisi di specifici parametri strutturali ha permesso di individuare potenziali instabilità nei modelli. I nostri dati mostrano che, nel modello dell’intera proteina transmembrana legata al cofattore PIP₂, la mutazione induce una marcata instabilità strutturale e una perdita di simmetria intersubunità a livello del filtro di selettività, con possibili effetti sulla conduzione ionica. L’analisi delle interazioni tra residui ha evidenziato il coinvolgimento di amminoacidi chiave appartenenti a catene adiacenti dei domini del poro e del sensore di voltaggio. Sulla base di queste osservazioni, il meccanismo proposto per l’inattivazione di corrente indotta dalla mutazione prevede il rafforzamento di un cluster idrofobico che coinvolge il residuo mutato e W288, generando una tensione locale nella catena proteica. Tale tensione si propaga fino alla regione del filtro, dove interrompe un’interazione di tipo π-stacking tra residui di tirosina conservati, un contatto noto per il suo ruolo cruciale nella stabilizzazione del filtro di selettività dei canali del potassio. Nel complesso, questi risultati rappresentano un primo passo verso la caratterizzazione atomistica del processo di inattivazione di corrente, che appare distinto dai meccanismi di inattivazione precedentemente descritti, delineando un nuovo meccanismo patogenetico per la KCNQ2-DEE causata dalla mutazione A265V, fondamentale per comprendere la fisiopatologia della malattia e orientare future strategie di intervento farmacologico.