La droplet digital PCR applicata alle frodi alimentari: convalida di un protocollo per identificare e quantificare la contraffazione delle salse di tartufo a base di Tuber aestivum vitt.

In a market characterized by frequent fraud involving high-value products such as truffles, protecting the supply chain requires increasingly sophisticated control tools. This thesis work focused on the development of a protocol using Droplet Digital PCR (ddPCR) technology, an advanced approach for molecular identification and quantification, to detect the species Tuber aestivum Vitt. within truffle sauces. The study was conducted by testing four specially prepared truffle sauces at different concentrations of T. aestivum to verify the system's sensitivity and reliability. Specifically, two samples with known concentrations were analysed, containing 7% (C7) and 3% (C3) of T. aestivum respectively, along with two 'unknown' samples whose concentrations, revealed post-analysis, were 10% (Unknown 2) and 0.2% (Unknown 1). DNA extracted from the fruiting body of T. aestivum was included as a positive control. First, a comparative evaluation was performed between two DNA extraction protocols (conventional CTAB method and a commercial kit) to determine which provided the best balance between quantitative yield and template purity. Each truffle sauce sample was tested across a wide range of template DNA concentrations (150, 30, 10, 6, 2 and 1 ng), to determine the assay's linearity. The latter, expressed through the slope of the regression lines, represents the number of target DNA copies detected per nanogram of sauce DNA analyzed, providing an objective parameter for quantifying the truffle present in the analyzed sauces. The results highlighted that the proposed protocol is able of accurately quantifying the amount of truffle within the sauce. Although the method does not allow for perfect quantification at extremely low concentrations, the stability of the regression line confirms the system's ability to discriminate, with a good approximation, even minimal truffle contents. Based on these findings, it can be stated that ddPCR represents a potentially suitable analytical tool for the quantification of truffle in processed sauces.

In un mercato caratterizzato da frequenti frodi ai danni di un prodotto pregiato come il tartufo, la protezione della filiera richiede strumenti di controllo sempre più sofisticati. In questo lavoro di tesi è stato messo a punto un protocollo, usando la tecnologia droplet digital PCR (ddPCR), per l’identificazione e quantificazione molecolare di Tuber aestivum Vitt., all’interno di salse tartufate, offrendo uno strumento innovativo per la tracciabilità del prodotto. Lo studio è stato condotto testando 4 salse tartufate appositamente preparate a differenti concentrazioni di T. aestivum con lo scopo di verificare la sensibilità e l’affidabilità del sistema. Nello specifico, sono stati analizzati due campioni a concentrazione nota, contenenti rispettivamente il 7% (C7) e il 3% (C3) di T. aestivum e due campioni "ignoti" la cui concentrazione, rivelata dopo l’analisi, è risultata essere del 10 % (Ignoto 2) e dello 0,2% (Ignoto1). Come controllo positivo è stato incluso nello studio DNA estratto da carpoforo di T. aestivum. In primo luogo, è stata condotta una valutazione comparativa tra due protocolli di estrazione del DNA (metodo convenzionale CTAB e Kit commerciale) per determinare quale garantisse il miglior equilibrio tra resa quantitativa e purezza del templato. Ogni campione di salsa tartufata è stato testato su un ampio intervallo di concentrazioni di DNA templato, (150, 30, 10, 6, 2 e 1 ng), al fine di determinare con precisione la linearità del saggio. Quest'ultima, espressa attraverso il coefficiente angolare delle rette di regressione, rappresenta il numero di copie di DNA target rilevate per nanogrammo di DNA di salsa analizzato, ha fornito un parametro oggettivo per la quantificazione del tartufo presente nelle salse analizzate. I risultati hanno evidenziato che il protocollo proposto è in grado di quantificare con fedeltà la quantità di tartufo all’interno della salsa. Nonostante per quantità estremamente basse il metodo non consenta una quantificazione perfetta. Tuttavia, la stabilità della retta di regressione conferma la capacità del metodo di discriminare con buona approssimazione anche contenuti minimi di tartufo. Sulla base dei risultati ottenuti si può affermare che la ddPCR può essere uno strumento analitico potenzialmente idoneo alla quantificazione del tartufo presente nelle salse tartufate.