Implementazione di modelli probabilistici per l’interpretazione di profili genetici misti in ambito forense mediante analisi di microaplotipi

The interpretation of mixed genetic profiles represents one of the most complex challenges in forensic genetics, particularly in the presence of low-template DNA, multiple contributors, and unbalanced mixture ratios. In this context, probabilistic genotyping constitutes the methodological reference for evaluating the weight of genetic evidence. In recent years, microhaplotypes (MHs) have emerged as alternative markers to traditional STRs, due to the absence of stutter artefacts, high multilocus informativeness, and compatibility with Massively Parallel Sequencing (MPS) technologies, which allow direct determination of allelic phase. The aim of this study was to implement and evaluate probabilistic genotyping models for the interpretation of mixed genetic profiles based on microhaplotypes generated by MPS, assessing the adaptability and reliability of software currently used in forensic practice. To this end, mixed DNA samples derived from certified NIST forensic reference material were analysed using a 74-plex microhaplotype panel and interpreted using two approaches: a fully continuous model (EuroForMix) and a semi-continuous qualitative model (LRmix Studio). The results demonstrate that both approaches are able to provide high and consistent Likelihood Ratio values for true contributors, even under low DNA input conditions. EuroForMix showed a strong ability to integrate quantitative information derived from sequencing coverage, allowing accurate estimation of mixture proportions in two-person mixtures, while revealing identifiability limitations in three-person profiles with extensive allele sharing. The semi-continuous analysis performed with LRmix Studio provided consistent results in terms of evidential weight assessment, despite relying exclusively on qualitative allele presence/absence information. Overall, this study supports the applicability of probabilistic models to the interpretation of microhaplotype-based mixtures and confirms the potential of these markers as a complement to STRs in forensic genetics, while also highlighting the need for further standardization and validation studies.

L’interpretazione di profili genetici misti rappresenta una delle sfide più complesse della genetica forense, in particolare in presenza di DNA a bassa quantità, più contributori e rapporti di miscela sbilanciati. In questo contesto, la genotipizzazione probabilistica costituisce il riferimento metodologico per la valutazione del peso dell’evidenza genetica. Negli ultimi anni, i microaplotipi (microhaplotypes, MHs) sono emersi come marcatori alternativi agli STR tradizionali, grazie all’assenza di artefatti di stutter, all’elevata informatività multilocus e alla compatibilità con le tecnologie di Massively Parallel Sequencing (MPS), che consentono una determinazione diretta della fase allelica. Lo scopo di questo studio è stato implementare e valutare modelli di genotipizzazione probabilistica per l’interpretazione di profili genetici misti basati su microaplotipi generati mediante MPS, verificando l’adattabilità e l’affidabilità di software attualmente utilizzati in ambito forense. A tal fine, campioni di DNA misto provenienti da materiale di riferimento forense certificato NIST sono stati analizzati mediante un pannello di 74 microaplotipi e interpretati utilizzando due approcci: un modello completamente continuo (EuroForMix) e un modello semi-continuo qualitativo (LRmix Studio). I risultati dimostrano che entrambi gli approcci sono in grado di fornire valori di Likelihood Ratio elevati e coerenti per i veri contributori, anche in condizioni di bassa quantità di DNA. EuroForMix ha mostrato un’elevata capacità di integrazione dell’informazione quantitativa derivante dalla copertura di sequenziamento, consentendo una stima accurata delle proporzioni di miscela nei casi a due contributori, ma evidenziando limiti di identificabilità nei profili a tre contributori con elevata condivisione allelica. L’analisi semi-continua condotta con LRmix Studio ha fornito risultati coerenti in termini di valutazione del peso dell’evidenza, pur basandosi esclusivamente su informazioni qualitative di presenza/assenza allelica. Nel complesso, questo studio supporta l’applicabilità dei modelli probabilistici all’interpretazione di miscele basate su microaplotipi e conferma il potenziale di questi marcatori come complemento agli STR nella genetica forense, evidenziando al contempo la necessità di ulteriori studi di standardizzazione e validazione.