APPROFONDIMENTI SPERIMENTALI SULLE VARIANTI DEL GENE MMACHC MEDIANTE UN NUOVO SISTEMA MINIGENE

Background: Methylmalonic aciduria and homocystinuria, cblC type, the most prevalent disorder of cobalamin (cbl) metabolism, results from genetic variants in the MMACHC gene. Although public databases document numerous splice variants of this gene, experimental evidence confirms pathogenicity for only a limited proportion. Methods: We constructed a plasmid system encompassing the complete coding sequence of the MMACHC gene, enabling direct validation of protein expression following the evaluation of MMACHC splice variant effects. Using a minigene assay, we evaluated the impact of selected variants on the splicing and quantified their protein expression levels. Results: 26 variants, including a subset of missense variants that are usually underestimated but can also lead to aberrant splicing, were predicted by splicing prediction tools. Experimental testing proved that 14 candidate variants disrupted normal splicing of the MMACHC gene and induced diverse splicing events that encompass exon skipping, partial exon skipping, intron retention, and cryptic splicing. However, 10 variants had no effect on pre-mRNA splicing but significantly lowered the protein expression levels. Conclusion: Our study elucidates the potential pathogenic mechanisms of some MMACHC variants and validates the utility of a novel plasmid system for the effective assessment of MMACHC variant pathogenicity. The application of this laboratory method for the analysis of patient-identified variants has the potential to be very valuable for the diagnosis of cblC disease at an early stage.

Background: L’aciduria metilmalonica e l’omocistinuria, tipo cblC, il più prevalente disturbo del metabolismo della cobalamina (cbl), derivano da varianti genetiche del gene MMACHC. Sebbene i database pubblici documentino numerose varianti di splicing di questo gene, solo per una proporzione limitata esistono evidenze sperimentali di patogenicità. Metodi: Abbiamo costruito un sistema plasmidico che comprende l’intera sequenza codificante del gene MMACHC, consentendo la validazione diretta dell’espressione proteica dopo la valutazione degli effetti delle varianti di splicing di MMACHC. Utilizzando un saggio di minigene, abbiamo valutato l’impatto di varianti selezionate sullo splicing e quantificato i livelli di espressione proteica. Risultati: Ventisei varianti, inclusi alcuni sottotipi di varianti missenso che solitamente vengono sottostimate ma che possono anch’esse determinare uno splicing aberrante, sono state predette da strumenti di previsione dello splicing. I test sperimentali hanno dimostrato che 14 varianti candidate alterano il normale splicing del gene MMACHC e inducono diversi eventi di splicing, tra cui skipping dell’esone, skipping parziale dell’esone, ritenzione dell’introne e splicing criptico. Tuttavia, 10 varianti non hanno avuto effetti sullo splicing del pre-mRNA, ma hanno ridotto significativamente i livelli di espressione proteica. Conclusione: Il nostro studio chiarisce i potenziali meccanismi patogenetici di alcune varianti di MMACHC e convalida l’utilità di un nuovo sistema plasmidico per la valutazione efficace della patogenicità delle varianti di MMACHC. L’applicazione di questo metodo di laboratorio per l’analisi delle varianti identificate nei pazienti ha il potenziale di essere molto preziosa per la diagnosi precoce della malattia cblC.