OTTIMIZZAZIONE DEL PROTOCOLLO DI TRASFORMAZIONE GENETICA DI EMBRIONI SOMATICI DEL PORTINNESTO DI VITE 110 RICHTER MEDIANTE MODULAZIONE DEL TEMPO DI CO-COLTURA CON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Among the biotic agents threatening wine production, Flavescence dorée represents a major threat to the entire sector, leading to the eradication of infected plants, for which no curative treatments are currently available. The only available strategies involve the control of the insect vector Scaphoideus titanus, which, through its feeding activity, is able to acquire and transmit this phytoplasma to other susceptible grapevines. Genetic transformation represents a biotechnology tool of particular interest for the introduction of agronomically relevant traits into grapevine, but its application is limited by the complexity of transformation protocols and by the strong influence of genotype on in vitro transformation and regeneration capacities. In particular, the use of genetically transformed rootstocks may be of interest within transgrafting strategies, making the development of efficient and reproducible transformation protocols for specific rootstock genotypes necessary. Therefore, the present work aimed to optimize the genetic transformation protocol of somatic embryos of the 110 Richter rootstock (Vitis berlandieri × V. rupestris) by modulating the duration of co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens. For this purpose, somatic embryos were subjected to three different co-cultivation periods, namely 3, 4 and 5 days, using the EHA101 strain of A. tumefaciens containing the construct designed to silence the ATP2 gene of Scaphoideus titanus through RNA interference. Following co-cultivation with A. tumefaciens, the embryos were transferred to selection media based on MS salts at full or half strength and monitored over a period of 15 weeks, evaluating GFP expression, the occurrence of necrosis and bacterial contamination. Monitoring GFP expression allowed the influence of co-cultivation duration on the evolution of transformed tissues during the subsequent selection and regeneration period to be assessed. The results were also analyzed in relation to the occurrence of necrosis and the presence of A. tumefaciens contamination, highlighting a relationship between increased co-cultivation duration and greater exposure of the embryos to the effects associated with the presence of the bacterium. The comparison between full-strength MS and half-strength MS media also allowed the response of the embryos to different nutritional conditions during the selection and regeneration phases to be evaluated, establishing, under the experimental conditions adopted, that reducing the salt concentration resulted in a higher occurrence of necrosis in the explants in culture. The integration of the target sequence into the plant genome was finally verified by PCR on the regenerated lines subjected to molecular analysis. Overall, the work allowed the regeneration and obtaining of two genetically modified lines of the 110 Richter rootstock, defining a 4-day co-cultivation period as the most efficient in terms of the expression of GFP-positive explants and, consequently, of the number of independent lines obtained. Therefore, co-cultivation duration was confirmed as a key parameter in the optimization of the genetic transformation of the 110 Richter rootstock.

Tra gli agenti biotici che minano la produzione vitivinicola, la flavescenza dorata rappresenta una vera minaccia per l’intero settore, portando all’eradicazione delle piante infette, e per la quale non ci sono interventi curativi. Le uniche strategie riguardano la lotta all’insetto vettore Scaphoideus titanus, che con le sue punture trofiche è in grado di assorbire e trasmettere questa fitoplasmosi ad altre viti ospiti. La trasformazione genetica rappresenta uno strumento biotecnologico di particolare interesse per l’introduzione di caratteri di interesse agronomico nella vite, ma la sua applicazione è limitata dalla complessità dei protocolli e dalla forte influenza esercitata dal genotipo sulle capacità di trasformazione e rigenerazione in vitro. In particolare, l’impiego di portinnesti geneticamente trasformati può assumere interesse nell’ambito di strategie di transgrafting, rendendo necessario lo sviluppo di protocolli di trasformazione efficienti e riproducibili per specifici genotipi di portinnesto. Il presente lavoro ha avuto pertanto l’obiettivo di ottimizzare il protocollo di trasformazione genetica di embrioni somatici del portinnesto 110 Richter (Vitis berlandieri × V. rupestris) mediante la modulazione della durata della co-coltura con Agrobacterium tumefaciens. A tale scopo, gli embrioni somatici sono stati sottoposti a tre differenti periodi di co-coltura, pari a 3, 4 e 5 giorni, utilizzando il ceppo EHA101 di A. tumefaciens contenente il costrutto finalizzato al silenziamento del gene ATP2 di Scaphoideus titanus, mediante RNA interference. Successivamente alla co-coltura con A. tumefaciens, gli embrioni sono stati trasferiti su terreni di selezione a base di sali MS a concentrazione intera o dimezzata e monitorati nel corso di 15 settimane, valutando la presenza di GFP, la comparsa di necrosi e la contaminazione batterica. La visualizzazione dell’espressione della GFP ha permesso di valutare l’influenza della durata della co-coltura sull’evoluzione dei tessuti trasformati durante il successivo periodo di selezione e rigenerazione. I risultati sono stati analizzati in relazione anche alla comparsa di necrosi e alla presenza di contaminazioni da A. tumefaciens, consentendo di evidenziare una relazione tra l’aumento della durata della co-coltura e la maggiore esposizione degli embrioni agli effetti associati alla presenza del batterio. Il confronto tra i substrati MS e MS ½ ha inoltre permesso di valutare la risposta degli embrioni a differenti condizioni nutrizionali durante le fasi di selezione e rigenerazione, stabilendo nelle condizioni sperimentali adottate, che il dimezzamento della concentrazione dei sali abbia favorito una maggiore insorgenza di necrosi negli espianti in coltura. L' integrazione della sequenza bersaglio nel genoma delle piante è stata infine verificata mediante PCR sulle linee rigenerate sottoposte ad analisi molecolare. Nel complesso, il lavoro ha permesso la rigenerazione e l’ottenimento di due linee geneticamente modificate del portinnesto 110 Richter, definendo il periodo di 4 giorni di co-coltura come il più efficiente in termini di espressione di espianti con GFP e conseguentemente di numero di linee indipendenti ottenute. Pertanto, la durata della co-coltura si conferma un parametro chiave nell’ottimizzazione della trasformazione genetica del portinnesto 110 Richter.