Caratterizzazione del complesso cisteina sintasi in microalghe

The Cysteine Synthase Complex (CSC) represents a key component in the regulation and maintenance of the homeostatic balance of sulfur metabolism in photosynthetic organisms. The CSC is formed through the interaction between the initiating enzyme of the biosynthetic pathway, serine acetyltransferase (SAT), and the enzyme responsible for L-cysteine synthesis, O-acetylserine(thiol)lyase (OAS-TL). While the structural and kinetic conservation of this multiprotein complex is extensively documented in terrestrial higher plants and freshwater microalgal models, the dynamics of this binding within the evolutionary lineages that characterize marine biology remain largely unexplored. The objective of this thesis work was to characterize the CSC in vitro using a strategy based on the recombinant SAT protein from Arabidopsis thaliana, engineered with an His-tag, affinity chromatography, and co-purification of algal enzymes. The results of the various purification experiments were analyzed via SDS-PAGE electrophoresis of the different chromatographic fractions. The data obtained demonstrate that the protocol is applicable to different species, although it was necessary to optimize certain steps of the experimental procedure in a species-specific manner. Further modifications will be required in future experiments to improve the purification yield, allowing for subsequent structural and functional analyses of CSC complexes from various algal species.

Il Complesso Cisteina Sintasi (CSC) rappresenta una componente chiave nella regolazione e nel mantenimento dell'equilibrio omeostatico del metabolismo dello zolfo negli organismi fotosintetici. Il CSC si forma grazie all'interazione tra l'enzima d'inizio della via biosintetica, la serina acetiltransferasi (SAT), e quello responsabile della sintesi della L-cisteina, la O-acetilserina(tiolo)liasi (OAS-TL). Mentre la conservazione strutturale e cinetica di tale complesso multiproteico è ampiamente documentata nelle piante superiori terrestri e in modelli microalgali d'acqua dolce, la dinamica di questo legame all'interno delle linee evolutive che caratterizzano la biologia marina rimane ancora inesplorata. Il presente lavoro di tesi si è posto l'obiettivo di caratterizzare il CSC in vitro sfruttando una strategia basata sull'impiego della proteina ricombinante SAT di Arabidopsis thaliana, ingegnerizzata con l’aggiunta di His-tag, cromatografia per affinità e co-purificazione di enzimi algali. I risultati dei vari esperimenti di purificazione sono stati analizzati tramite elettroforesi SDS-PAGE delle varie frazioni cromatografiche. I dati ottenuti mostrano come il protocollo sia applicabile a diverse specie, pur se è stato necessario ottimizzare in modo specie-specifico alcune fasi della procedura sperimentale e ulteriori modifiche saranno necessarie in esperimenti futuri, al fine di migliorare la resa della purificazione stessa per poter procedere con analisi strutturali e funzionali di complessi CSC di diverse specie algali