CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE DI COMPLESSI aIF5A-RNA

The study presented in this thesis concerns the multifunctional protein aIF5A, derived from the model organism Sulfolobus solfataricus, through biophysical and molecular biology techniques. The RNase activity of aIF5A has been investigated by in vitro degradation assays. Its structural properties in solution and in the presence of RNA have been studied using the Small Angle X-ray Scattering (SAXS) technique. This work first considers some information about aIF5A, comparing this protein with the homologue of bacteria and eukaryotes, describing its molecular structure, post-traslational modifications and related functions. Subsequently, we describe the methods adopted in this study: first the extraction of the ribosomal RNA from S. sulfataricus ribosomes and then the in vitro degradation assays on 16S and 23S ribosomal RNAs in the presence of the aIF5A protein. Furtherly, we describe the SAXS technique, showing the main biophysical laws at the basis of this method, we introduce the synchrotron facility and how this instrument is used for the SAXS measurements. Finally, we report the results obtained through the experimental SAXS curves recorded and interpreted starting from the biophysical laws previously introduced. The structural analysis of the aIF5A factor isolated from Sulfolobus solfataricus has the purpose to deepen the knowledge of the process of protein synthesis in the Archaea domain: the SAXS measurements carried out at high temperature have allowed to obtain structural information in conditions very similar to the physiological ones. Results obtained allow to compare the translational apparatus of the Archaea with those of the Eukaryotes, explaining some aspects that have been preserved during the evolution and thus providing a model for the study of the eukaryotic factors of translation, most of them involved in pathological cellular processes.

Il lavoro svolto in questa tesi riguarda lo studio della proteina multifunzionale aIF5A, derivata dall'organismo modello Sulfolobus solfataricus, mediante tecniche biofisiche e di biologia molecolare. L’attività RNasica di aIF5A è stata studiata mediante saggi di degradazione in vitro. Le sue proprietà strutturali in soluzione e in presenza di RNA sono state studiate mediante la tecnica di diffusione di raggi X a piccolo angolo (Small Angle X-ray Scattering, SAXS). La seguente trattazione analizza dapprima tutte le informazioni riguardo questa proteina, confrontandola con l’omologa dei batteri e degli eucarioti, descrivendone la struttura molecolare, le modifiche post-traduzionali e le relative funzioni. Successivamente vengono esposti i metodi adottati in questo studio: dapprima è descritta l’estrazione dell’RNA ribosomiale dai ribosomi di S. solfataricus e in seguito sono descritti i saggi di degradazione in vitro su l’RNA ribosomiale 16S e 23S in presenza della proteina aIF5A. In seguito, viene approfondita la tecnica SAXS, esponendo le principali leggi biofisiche alla base di questo metodo ed il funzionamento dello strumento impiegato nelle misurazioni: il sincrotrone. Vengono riportati, infine, i risultati ottenuti mediante le curve sperimentali SAXS registrate presso un sincrotrone e interpretate a partire dalle leggi biofisiche enunciate precedentemente. L’analisi strutturale del fattore aIF5A isolato da Sulfolobus solfataricus ha lo scopo di approfondire la conoscenza del processo di sintesi proteica all’interno del dominio degli Archea: le misure SAXS svolte ad alta temperatura hanno infatti permesso di ottenere informazioni strutturali in condizioni molto affini a quelle reali. I risultati ottenuti permettono di confrontare gli apparati di traduzione degli archeobatteri con quelli degli eucarioti, chiarendo alcuni aspetti che si sono conservati durante l’evoluzione e quindi fornendo un modello per lo studio dei fattori della traduzione eucariotica, molti dei quali sono coinvolti in processi cellulari patologici.