QUALITA' NUTRIZIONALE E BENIFICI SULLA SALUTE DEL CECE (CICER ARIETINUM L.): FOCUS SUL CONTENUTO PROTEICO

Chickpea (Cicer arietinum L.) is a self-pollinated, annual diploid (2n=2x=16) legume species, with a relatively small genome size (~740Mbp). It is one of the most cultivated legume crops and a potential source of proteins with desirable nutritional and functional properties. Knowledge and consumption of plant proteins should be encouraged for both healthy and sustainability reasons. The main aim of this work was to develop an efficient and rapid protocol to optimize the total protein extraction from chickpea seeds to be used to phenotype, for such trait, large collection of different genotypes. The first step was to obtain a fine powdered tissue from chickpea seeds; two grinding methods have been compared consisting in the use of mortar and pestle and a TissueLyser, respectively. In both cases low temperature was guaranteed by the use of liquid nitrogen. A trichloroacetic acid (TCA) in acetone extraction method and a phenol extraction method have been, then, compared to optimize protein extractions from chickpea flours. SDS-PAGE analysis has been employed to identify protein subunits based on their molecular weights. Many electrophoretic analyses with gels at different polyacrylamide concentrations and loaded with different protein amounts have been performed to identify the method that gives the best protein resolution. The results showed that the most efficient method in term of time saving and protein extract’s quality consists in: i) grinding with mortar and pestle in liquid nitrogen; ii) TCA/Acetone extraction; iii) SDS-PAGE analysis with AnyKd precast gel (Biorad®) by loading samples containing 15μg proteins. Six chickpea genotypes (four Kabuli, two Desi) have been analysed with this method to detect if differences in protein content and profiles exist among the diverse chickpea genotypes. The SDS-PAGE analysis showed that the most abundant proteins in chickpea seeds have molecular weights in the ranges 20-25 kDa, 35-40 kDa and 50-70 kDa. They correspond mainly to globulins (11S legumin; 7S vicilin) and albumins, which are the most concentrated proteins in chickpea. Minor protein fractions correspond to glutenin (110 and 55 kDa), lipoxygenase (96 kDa) and prolamin. Protein content seems to be higher in Kabuli types than Desi. In conclusion, the optimized method described in this work can be applied to effectively analyse the protein profile in large collections of chickpea seeds, and for further analyses like Western blot, chromatography and MS spectrometry. Moreover, even if only six genotypes were tested it was possible to highlight some differences in terms of protein content and profiles.

Il cece (Cicer arietinum L.) è una specie autogama, annuale e diploide (2n = 2x = 16), caratterizzata da un genoma relativamente piccolo (~740 Mbp). È una delle leguminose più coltivate e rappresenta una potenziale fonte di proteine con importanti proprietà nutrizionali e funzionali. Studi focalizzati sull’analisi delle proteine vegetali e sul loro consumo dovrebbero essere incoraggiati perché migliorano la salute e la sostenibilità ambientale. Il principale obiettivo di questo lavoro è stato lo sviluppo di un protocollo rapido ed efficiente che ottimizzasse l’estrazione delle proteine totali da semi di cece, che possa essere utilizzato per fenotipizzare questo carattere nutrizionale in collezioni ampie di diversi genotipi di cece. Il primo esperimento è stato il confronto di due diversi metodi di macinazione per ridurre il tessuto in una polvere fine; in particolare la macinazione è stata effettuata con mortaio e pestello e con un TissueLyser, mantenendo in entrambi i casi una temperatura al di sotto dello zero (utilizzo di azoto liquido). Successivamente, il metodo di estrazione delle proteine con acido tricloroacetico (TCA) in acetone è stato confrontato con il metodo di estrazione con fenolo. L'analisi SDS-PAGE è stata impiegata per identificare le proteine basandosi sui rispettivi pesi molecolari. Numerose corse elettroforetiche con gel a diverse concentrazioni di poliacrilammide, caricati con campioni a diverso contenuto proteico, sono state effettuate per selezionare il metodo che offrisse la migliore risoluzione delle proteine. Dai risultati ottenuti è emerso che il metodo più efficiente in termini di risparmio di tempo e qualità dell’estratto prevede: i) macinazione dei semi mediante mortaio e pestello in azoto liquido; ii) metodo di estrazione con TCA in acetone; iii) SDS-PAGE con gel “precasted” ‘’AnyKd (Biorad®)’’ caricato con campioni contenenti 15μg di proteine. Il metodo è stato utilizzato per analizzare sei diversi genotipi di cece (quattro appartenenti alla tipologia Kabuli e due alla Desi) al fine di rilevare eventuali differenze a livello di contenuto e profilo proteico. Dalla caratterizzazione in SDS-PAGE è emerso che le proteine più abbondanti nei semi di cece sono comprese tra 20-25 kDa, 35-40 kDa e 50-70 kDa. Queste frazioni corrispondono principalmente a globuline (leguminosa 11S; vicilina 7S) e albumine, che sono le proteine più concentrate nel cece. Le frazioni minori corrispondono a glutenina (110 e 55 kDa), lipossigenasi (96 kDa) e prolamina. Il contenuto proteico sembra essere più alto nei tipi Kabuli rispetto ai Desi. Il metodo sviluppato in questo lavoro può essere utilizzato per analizzare efficacemente il profilo proteico di semi di ampie collezioni di genotipi diversi di cece e per la caratterizzazione mediante ulteriori analisi, quali Western blot, cromatografia e spettrometria MS. Infine, anche se soltanto sei genotipi diversi sono stati utilizzati è stato possibile evidenziare alcune differenze per quanto riguarda il contenuto e il profilo proteico.