CELLULE ENDOTELIALI E PLASMI DI BAMBINI OBESI: UN MODELLO INNOVATIVO IN VITRO PER LO STUDIO DEI MECCANISMI BIOMOLECOLARI IMPLICATI NELLA DISFUNZIONE ENDOTELIALE NELL’OBESITA’ INFANTILE

Childhood obesity is characterized by vascular insulin resistance along with altered oxidant-antioxidant state and chronic inflammation, which play a key role in the onset of endothelial dysfunction. Recently, it has been demonstrated a reduced Nitric Oxide (NO) bioavailability in Human Umbilical Vein Endothelial cells (HUVECs) cultured with plasma from obese pre-pubertal children (OB) as compared with plasma from normal-weight children (CTRL). However, mechanisms causing endothelial dysfunction in childhood obesity are still not entirely clear. Thus, the aim of the present thesis is to better clarify the mechanisms responsible for endothelial dysfunction establishment in childhood obesity, using the aforementioned innovative in vitro model. More in detail, the effects of HUVECs incubation with OB-plasma on intracellular levels of oxidative stress and on the regulation of pro-and and anti-atherogenic insulin pathways have been investigated. In addition, the potential involvement of mammalian Target of Rapamycin Complex1 (mTORC1)-ribosomal protein S6 Kinase beta1 (S6K1) pathway, known to have a role in regulating the insulin pathway, was also evaluated. OB-children (N = 32, age: 9.2 ± 1.7; BMI z-score: 2.72 ± 0.31) had higher fasting insulin levels and increased Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance (HOMA-IR) than CTRL-children (N = 32, age: 8.8 ± 1.2; BMI z-score: 0.33 ± 0.75). In vitro, HUVECs exposed to OB- compared to CTRL-plasma (both 16 hours incubation) exhibited significant increase in Reactive Oxygen Species (ROS) levels, higher vascular and intercellular adhesion molecules exposure, together with increased monocytes-endothelial interaction. This was associated with unbalanced pro- and anti-atherogenic endothelial insulin stimulated signaling pathways, as measured by increased Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) activation and decreased Insulin Receptor Substrate-1 4 (IRS-1) and protein kinase B (Akt) phosphorylation levels, together with augmented S6K1 activation. Interestingly, inhibition of mTORC1-S6K1 pathway using rapamycin significantly restored the IRS-1/Akt activation, suggesting a feedback regulation of IRS-1/Akt signal through S6K1. Overall, these findings shed light on potential new mechanisms underlying endothelial dysfunction in childhood obesity.

L’obesità infantile è comunemente associata a disfunzione endoteliale, una condizione caratterizzata da alterazioni del segnale insulinico, da una ridotta biodisponibilità di Ossido Nitrico (NO), da aumentato stress ossidativo ed infiammazione cronica. Recentemente, è stata dimostrata una riduzione della biodisponibilità NO nelle cellule endoteliali derivate da vena di cordone ombelicale umano (HUVECs, Human Umbilical Vein Endothelial Cells) in seguito al trattamento con il plasma di bambini prepuberi obesi (OB), rispetto al plasma di bambini normopeso (CTRL, controllo). Tuttavia, i meccanismi alla base di tali alterazioni non sono stati del tutto chiariti. Pertanto, utilizzando lo stesso modello sperimentale, l’obiettivo principale della presente tesi è valutare se il plasma OB rispetto al plasma di bambini CTRL possa indurre: (i) un aumento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS, reactive oxygen species); (ii) uno squilibrio tra le vie insuliniche pro- ed anti-aterogenica; (iii) un aumento dell'interazione monociti-endotelio. Inoltre, al fine di studiare il meccanismo coinvolto, si ipotizza di valutare il potenziale coinvolgimento della via di segnale regolata dal complesso 1 bersaglio della rapamicina (mTORC1) e del suo bersaglio a valle, la proteina-chinasi 1 p70-S6 (S6K1), molecole note per essere coinvolte nella modulazione della via di segnale dell’insulina. I risultati ottenuti indicano che i bambini OB (N = 32, età: 9,2 ± 1,7; BMI z-score: 2,72 ± 0,31) presentavano livelli plasmatici di insulina a digiuno più alti e un’aumentata insulino-resistenza (HOMA-IR) rispetto ai bambini CTRL (N = 32, età: 8,8 ± 1,2; BMI z-score: 0,33 ± 0,75). In vitro, le HUVECs incubate per 16 ore con il plasma OB, a differenza dei controlli, mostravano un aumento significativo dei livelli di ROS, dell’esposizione di membrana delle molecole di adesione vascolare e intercellulare (VCAM-1, ICAM-1) e 2 dell’adesione dei monociti all’ endotelio. Ciò era associato ad uno squilibrio delle vie di segnale insuliniche pro- ed anti-aterogenica, come dimostrato dall'aumento di attivazione della proteina chinasi mitogenica attivata (MAPK) e dalla contemporanea diminuzione dei livelli di fosforilazione del substrato 1 del recettore dell’insulina (IRS1) e della proteina chinasi B (Akt), insieme all’aumento di attivazione di S6K1. In maniera interessante, l’utilizzo della rapamicina, noto inibitore della via di segnale mTORC1-S6K1, ripristinava in modo significativo l'attivazione della via insulinica IRS-1/Akt, suggerendo una regolazione di tipo feedback di tale via attraverso S6K1. Nel complesso, tali risultati evidenziano nuovi potenziali meccanismi alla base dell'insorgenza della disfunzione endoteliale nell'obesità infantile.