DETECTION OF OCHRATOXIN A–PRODUCING FUNGI IN GRAPES FROM MARCHE VINEYARDS

Le specie appartenenti alla sezione Aspergillus Nigri (black aspergilli) sono i principali contaminanti fungini delle uve. Oltre alla loro capacità di causare marciume nero, possono produrre ocratossina A (OTA), una micotossina con effetti nefrotossici, immunotossici e cancerogeni nell’uva e nei prodotti derivati rappresentando un rischio elevato per la salute pubblica. Al fine di valutare il rischio di contaminazione dell'uva, è stata raccolta nel Settembre 2018 la microflora da grappoli di uva appartenenti alla varietà ‘Verdicchio’ coltivata in un vigneto commerciale collocato nella provincia di Ancona – Italia. Il micelio fungino è stato isolato e caratterizzato morfologicamente e con tecniche molecolari. Utilizzando il saggio PCR di High Resolution Melting (PCR-HRM) è stato messo a punto un metodo rapido per identificare alcune tra le specie fungine incluse in Aspergillus spp.. Primers relativi al gene della β-tubulina sono stati selezionati utilizzando la versione Primer3web 4.1.0. (http://bioinfo.ut.ee/primer3- 0.4.0 /), in grado di includere specifiche varianti nucleotidiche relative alle specie A. tubingensis, A. niger, A. welwitschiae, A. luchuensis, A. brasisliensis, A. awamori e A. neoniger. L'indagine HRM della curva di melting dei frammenti PCR amplificati ha evidenziato che tutti gli isolati selezionati in questo lavoro avevano la stessa sequenza nucleotidica che si univa nel medesimo gruppo. L’analisi dei frammenti PCR sequenziati effettuata mediante Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), ha confermato che tutti gli isolati analizzati in questo lavoro erano omologhi delle specie A. tubingensis del 98,88% suggerendo una possibile ricombinazione tra A. tubingensis, A. niger e/o A. welwitschiae associata ai geni della β-tubulina. Inoltre, i test PCR basati sul gene polichetidiche sintetasi (PKS) coinvolto nella biosintesi delle ocratossine, suggeriscono che questi isolati potrebbe produrre OTA. Tuttavia ulteriori indagini devono essere condotte per verificare la corretta sequenza genica PKS associata a questi isolati da uva.

Species belonging to Aspergillus section Nigri (black aspergilli) are the main fungal contaminants of table grapes. Besides their ability to cause black rot, they can produce ochratoxin A (OTA), which is a mycotoxin with nephrotoxic, immunotoxic, and carcinogenic effects in grape derivative products. In order to evaluate the risk of contamination of grape and grape derivative products, the mycoflora from grapes, Verdicchio cultivar, harvested in September 2018 in the province of Ancona - Italy, were isolated and fungi were determinated by morphologically and by applying molecular tools. Using High‐Resolution Melting Polymerase Chain Reaction (HRM‐PCR) approach, a rapid method for the identification of fungal species Aspergillus spp. section Nigri was set-up. The primer pairs selected on β-tubulin genes including several specific nucleotide variants which belong to A. tubingensis, A. niger, A. welwitschiae, A. luchuensis, A. brasisliensis, A. awamori, and A. neoniger species were selected using Primer3web version 4.1.0. (http://bioinfo.ut.ee/primer3- 0.4.0/). Melt curve analysis confirms the all isolates selected in this work, are clustered in the same group. The Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), analysis of amplicon sequences generated by HRM-PCR confirms that all isolates selected in this work were homologous to A. tubingensis species of 98.88%. This suggests a possible recombination among A. tubingensis and A. niger or A. welwitschiae sequence associated to β-tubulin genes. In addition, the PCR assays based on polyketide synthases (PKS) involved in OTA biosynthesis suggest that this isolate could produce OTA, but future investigation must be performed for gene sequence prediction.