PRODUZIONE DELLA LATTOTRANSFERRINA BOVINA NEL LIEVITO METILOTROFICO PICHIA PASTORIS: UN MODELLO DI FERMENTAZIONE DI PRECISIONE IN BIOREATTORE PER APPLICAZIONI ALIMENTARI.

Climate change is the biggest threat of the 21st century. Scientific data show an evident correlation between the global temperature increase and the greenhouse gases (GHGs) levels in the atmosphere. Anthropogenic activities are the main cause of current global warming. The average temperature of Earth has already risen by 1.2°C since the pre-industrial period, the sea level has increased by 24 cm and extreme climate events are more and more frequent. To stabilize temperature increase to below 2°C, the goal of the 2015 Paris Agreements, and avoid catastrophic scenarios, Homo sapiens will have to reach “carbon neutrality” by 2050, reducing the emissions from every sector of modern society. Food systems are responsible for one-third of global GHGs and the world population will grow up to 10 billion people by 2050, causing a 70% increase in the demand for food. Cellular agriculture is the process of farming animal products from cells instead of animals, cutting down GHGs emissions and the use of natural resources, without asking for mass behaviour change. Designing new-generation infant formula could be a smart and immediate application of this cutting-edge technology. The main topic of this work was the production of recombinant bovine Lactotransferrin (bLtf) in the methylotrophic yeast P. pastoris (his4 GS115 strain), carrying out both upstream and downstream steps of this precision fermentation bioprocess. The bLtf protein has unique healthy characteristics and could be used as an ingredient to create innovative infant formulas. The steps of the research were the following: target sequence analysis, plasmid vector and primers design, molecular cloning techniques, bacterial and yeast transformation, protein expression through shake flasks and bench-top bioreactors scale, protein concentration and quantification. The bLtf sequence, after codon usage optimization and removal of the native signal peptide, was inserted in the pPIC9 vector, in frame with the alpha-MF signal sequence. This was amplified in Escherichia coli, then extracted and purified. After complete linearization, pPIC9-bLtf was used to transform his4 GS115 competent cells by the lithium chloride method. Three positive transformants (namely “E6”, “C6” and “C8”) were confirmed by PCR analysis and then plate-screened, showing the MutS phenotype. The E6 transformant displayed the most interesting protein expression pattern after the first shake flask induction tests. Aeration and methanol feeding optimization of induction conditions of the E6 transformant played important roles in increasing the total secreted proteins expression and biomass accumulation. After a one-step approach, the yield of total extracellular proteins reached a maximum level of 140 mg/L and 400 mg/L in shake flasks and 3-L bioreactor, respectively. Western Blot analysis will be essential to confirm the proper expression of the bLtf protein, along with an efficient purification protocol (size-exclusion chromatography via FPLC or similar techniques) also usable to precisely quantify it. To fine-tune the bioprocess and increase the final protein yield, further steps of optimization of the induction conditions such as aeration, methanol concentration, pH, temperature and media composition, will be crucial. These overall activities will make this precision fermentation project promising for large-scale nutrition applications.

La crisi climatica è la principale minaccia del 21° secolo. Solidi dati scientifici mostrano una correlazione diretta tra l’aumento della temperatura ed i livelli di gas serra nell’atmosfera. L’uomo ha contribuito al rilascio nell’ambiente di quantità ingenti di gas con elevato potere riscaldante. La temperatura globale è aumentata di circa 1.2°C rispetto ai livelli del 18° secolo, il livello del mare è salito di 24 cm ed eventi climatici estremi sono all’ordine del giorno. Per limitare il riscaldamento sotto 2°C, l’obiettivo degli accordi di Parigi 2015, e scongiurare scenari catastrofici, H. sapiens deve raggiungere la “carbon neutrality” entro il 2050, rivoluzionando ogni settore della società cosicché la quantità di gas serra emessi sia equivalente o minore di quella che può essere assorbita dal sistema Terra. Il Food Sector è destinato ad una rivoluzione radicale perché contribuisce ad un terzo di tutte le emissioni; inoltre, la popolazione mondiale raggiungerà i 10 miliardi entro il 2050, accompagnata da un aumento della produzione globale di cibo del 70%. L’Agricoltura Cellulare si pone come obiettivo la creazione di prodotti animali attraverso la coltivazione di cellule staminali o la fermentazione di microrganismi, riducendo l’impatto ambientale fino al 90%. Un’applicazione immediata potrebbe essere la produzione di latte in polvere di nuova generazione. L’argomento della tesi è stata la realizzazione di un processo di fermentazione di precisione (PF) in bioreattore per la produzione della Lattotransferrina bovina (bLtf) nel lievito Pichia pastoris (his4 GS115 strain). Questa proteina possiede proprietà salutari e funzionali uniche e potrebbe essere utilizzata come ingrediente per la formulazione di latti in polvere innovativi. Gli step del lavoro sono stati i seguenti: analisi della sequenza di DNA target, disegno del vettore plasmidico e dei primers, varie tecniche di clonaggio molecolare, trasformazione di cellule batteriche e di lievito, espressione della proteina sia in beuta che in bioreattore, ed infine concentrazione e quantificazione. L’obiettivo del lavoro era la creazione di un modello in media scala che potesse in futuro essere adattato a contesti industriali. La sequenza del gene della bLtf, priva del segnale di secrezione nativo ed ottimizzata per l’espressione in lievito, è stata inserita nel vettore integrativo pPIC9. Questo è stato propagato in Escherichia coli, successivamente estratto e purificato. Dopo completa linearizzazione, pPIC9-bLtf è stato utilizzato per la trasformazione delle cellule di lievito con litio cloruro. Tre trasformanti positivi sono stati confermati tramite PCR e successivamente sottoposti a screening su piastra, manifestando tutti il fenotipo MutS. Quello nominato “E6” è risultato il più promettente dopo i primi test di espressione in beuta. La messa a punto delle condizioni di induzione, tra cui l’ossigenazione e la quantità di metanolo aggiunta, hanno permesso di aumentare la biomassa finale e la quantità di proteine secrete nel liquido di coltura. Dopo un approccio di ottimizzazione one-step, la resa massima delle proteine extracellulari è risultata di 140 mg/L in beuta e 400 mg/L in bioreattore da 3-L. Oltre al Western Blot che sarà necessario per confermare l’espressione della bLtf, bisognerà mettere a punto un processo di isolamento e purificazione della bLtf dal liquido di coltura (FPLC o altra tecnica cromatografica), propedeutico alla quantificazione precisa della stessa. Per ottenere una resa maggiore della proteina saranno necessari altri test di induzione con differenti condizioni di aereazione, pH, temperatura, metanolo e diverse composizioni del terreno di coltura che possono favorire l’espressione proteica. Ciò permetterà di migliorare il modello di fermentazione di precisione presentato in questo lavoro, così da renderlo di interesse per applicazioni industriali.