Studente VENTURA, SOFIA
Facoltà/Dipartimento Dipartimento Scienze della Vita e dell'Ambiente
Corso di studio BIOLOGIA MOLECOLARE E APPLICATA
Anno Accademico 2021
Data dell'esame finale 2022-07-20
Titolo italiano Produzione ricombinante, caratterizzazione mediante diffusione a piccolo angolo dei raggi X e saggi funzionali della proteina beta-amiloide.
Titolo inglese Recombinant production, characterization by small-angle X-ray scattering, and functional assays of the beta-amyloid protein.
Abstract in italiano La presenza di placche di amiloide-beta (Aβ) è un segno distintivo della malattia di Alzheimer. Capire come questa proteina inizialmente solubile si ripiega e contribuisce alla degenerazione, è fondamentale per lo studio della malattia. Molti studi sull'aggregazione e la tossicità dell'Aβ attualmente utilizzano l'Aβ ottenuto per sintesi chimica grazie alla facilità di acquisto e alla poca manipolazione richiesta per ottenere l'Aβ allo stato monomerico; tuttavia, le differenze nei protocolli di disaggregazione possono anche introdurre strutture eterogenee nel peptide di partenza. L'HFIP è ampiamente utilizzato per disaggregare l'Aβ, ma può anche portare alla formazione di strutture oligomeriche, poiché il peptide viene portato a pH neutro tramite il suo punto isoelettrico e alla formazione di strutture aggregate. Su queste basi, la presente tesi mira a produrre la proteina Aβ42 ricombinante da E. Coli, aggirando alcune delle questioni sopra sollevate. La mia tesi si è concentrata sulla produzione della proteina beta-amiloide, in modo semplice e relativamente veloce. Vari fattori hanno contribuito alla produzione di questa proteina, il fatto che il promotore del plasmide fosse un promotore molto forte (T7), ha permesso, sotto induzione, una produzione della proteina in grande quantità nei corpi di inclusione di Coli BL21. La produzione nei corpi di inclusione, in questo caso, è stata un fattore di aiuto, in quanto la proteina rimane isolata da tutte le altre componenti cellulari e può essere purificata semplicemente rompendo i corpi di inclusione. Uno dei fattori chiave nello studio della proteina beta amiloide (soprattutto 42) è averla in forma monomerica, che con questo protocollo si ottiene, anche se per un tempo limitato. Grazie alla sua produzione, è stato possibile eseguire studi SAXS preliminari delle prime strutture proteiche aggregate. Inoltre, in seguito ai dati di sequenziamento e ai saggi in Tioflavina T, è stato possibile sia valutare la correttezza della proteina prodotta sia misurarne la risposta al colorante fluorescente. In particolare, la concentrazione ottimale di 25 M di ThT e  riflette il rapporto 1:1 raccomandato in questo tipo di saggio. Grazie alla possibilità di ottenere un  ricombinante, sarà possibile in futuro studiarne a fondo la struttura ei molteplici stati conformazionali che esso forma in relazione alle condizioni fisico-chimiche, comprendere come A assembla in fibrille, e, soprattutto, quali strategie possono essere applicate per studiarne l'inibizione.
Relatore SPINOZZI, FRANCESCO
Controrelatore SILVESTRINI, LUCIA
Appare nelle tipologie: Laurea specialistica, magistrale, ciclo unico
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Recombinant production, characterization by small angle diffusion of X-rays, and functional assays of the beta-amyloid protein (2).pdf   fino a2024-01-21 Produzione ricombinante, caratterizzazione mediante diffusione a piccolo angolo dei raggi X e saggi funzionali della proteina beta-amiloide. 2.71 MB Adobe PDF

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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/20.500.12075/9716