EFFETTI BIOLOGICI DEI COMPOSTI FARMACEUTICI IN MYTILUS GALLOPROVINCIALIS: MODULAZIONE DEL SISTEMA IMMUNITARIO E DEL METABOLISMO OSSIDATIVO

In recent years, interest on the potential consequences of pharmaceuticals in aquatic ecosystem is increased, due to their ubiquitous presence in water systems and their potential adverse effects for non-target aquatic species. Since wild organisms are continuously exposed to a cocktail of chemical substances, including pharmaceuticals with different chemical-physical properties and modes of action (MOA), it is necessary to investigate potential interactions within the mixtures that can modify molecules toxicity causing potential additive, synergistic or antagonistic biological effects. The present study aimed to investigate the ecotoxicological potential of four pharmaceuticals therapeutic classes, including the antidepressant venlafaxine (VEN), the lipid regulating agent gemfibrozil (GEM), the antihypertensive ramipril (RAM) and the antidiabetic metformin (MET) and their mixture in model organism Mytilus galloprovincialis. The experimental plan provided mussels’ 30-day exposure to single pharmaceuticals and mixture at environmental realistic concentration of 1 µg/L, followed by 14 days in pharmaceuticals-free seawater, intended as a depuration phase, to assess their recovery capacity. An ecotoxicological approach, which integrates the responsiveness of various biochemical and cellular responses such as genotoxicity and modulation of the immune and oxidative system, was applied. Overall results of the immune system indicated the lysosomal membrane stability and the phagocytosis capacity of haemocytes as the most sensitive endpoints for the tested drugs, indicating the lipid regulating agent GEM and the antihypertensive RAM as the most effective among the used therapeutic classes. The lack of significant variations in micronuclei frequency for all treatments highlighted the non-genotoxicity of the tested compounds. Outcomes on antioxidant system suggested phase II conjugation reactions as one of the key processes for tested pharmaceuticals metabolism in mussels, with an induction of glutathione-S-transferase (GST) and a consequent decrease in level of total glutathione (GSH) for all treatments. Statistically significant catalase (CAT) induction was highlighted for GEM, due to his activity as Peroxide Proliferator Agent (PPA) increased the levels of Radical Oxidative Species (ROS); while a biphasic and delayed response of VEN was highlighted in activity of enzymes glutathione reductase (GR) and peroxidase (GPx CHP and GPx H2O2). In conclusion, outcomes of this thesis enhanced the comprehension of the main pathways involved in pharmaceuticals metabolism, indicating dependent effects by the MOAs of different investigated therapeutic class. Furthermore, overall results provided a novel insight into potential additive interaction among drugs within the mixture, suggesting the importance of studying the combinate effects of different therapeutic classes in order to acquire a more comprehensive understanding of their impact on non-target organisms.

La presenza ubiquitaria dei composti farmaceutici negli ecosistemi acquatici e i conseguenti possibili effetti avversi nelle specie non-target, hanno fatto sì che negli ultimi anni aumentasse l’interesse della comunità scientifica nei confronti di questa problematica. In ambiente naturale, gli organismi marini sono continuamente esposti ad un insieme di sostanze chimiche, inclusi i farmaci e molti altri tipi di inquinanti. Considerato che ogni molecola è caratterizzata da proprietà chimico-fisiche e un meccanismo d’azione differenti, risulta estremamente importante comprendere le possibili interazioni additive, sinergiche o antagoniste che possono instaurarsi all’interno delle miscele. Il presente studio ha come obiettivo quello di valutare il potenziale ecotossicologico di quattro diverse classi terapeutiche di farmaci, che includono l’antidepressivo venlafaxina (VEN), il regolatore lipidico gemfibrozil (GEM), l’antipertensivo ramipril (RAM), l’antidiabetico metformina (MET) e la loro miscela, nell’organismo modello Mytilus galloprovincialis. Il piano sperimentale ha previsto una fase di esposizione di 30 giorni, durante la quale gli organismi sono stati esposti alla concentrazione ambientalmente realistica di 1 µg/L di singoli farmaci e della miscela. Al termine della fase di esposizione i mitili sono stati lasciati per ulteriori 14 giorni in acqua priva di farmaci allo scopo di valutare la capacità di recupero dalle molecole testate. È stato in seguito applicato un approccio ecotossicologico che integra la misura di diverse risposte biologiche in grado di evidenziare l’insorgenza di alterazioni biochimiche e cellulari come la genotossicità e la modulazione del sistema immunitario ed ossidativo. I risultati relativi alle risposte del sistema immunitario hanno evidenziato che la stabilità della membrana lisosomiale e la capacità di fagocitosi degli emociti sono i parametri più sensibili ai farmaci testati, indicando un effetto maggiore per il regolatore lipidico GEM e l’antipertensivo RAM rispetto alle altre classi terapeutiche investigate. Nessuno dei trattamenti ha indotto variazioni nella frequenza dei micronuclei, confermando la non genotossicità dei composti testati. I risultati del sistema ossidativo hanno mostrato un’induzione statisticamente significativa della glutatione-S-transferasi (GST) con conseguente diminuzione dei livelli totali di glutatione (GSH) per tutti i trattamenti, suggerendo che il processo di biotrasformazione di fase II è il percorso principale per la detossificazione dei mitili dai farmaci testati. Un'induzione statisticamente significativa della catalasi (CAT) è stata misurata a seguito dell'esposizione a GEM, giustificata dalla produzione di H2O2 potenzialmente dovuta all’azione di GEM come proliferatore perossisomale; mentre una modulazione dell'attività degli enzimi glutatione reduttasi (GR) e perossidasi (GPx CHP e GPx H2O2) è stata rilevata per VEN, evidenziando inoltre una risposta bifasica e ritardata causata da questa molecola. In conclusione, i risultati di questa tesi hanno migliorato la comprensione delle principali vie metaboliche coinvolte nella risposta cellulare ai composti farmaceutici, indicando effetti dipendenti dai meccanismi d’azione delle diverse classi terapeutiche indagate. Inoltre, questi risultati hanno anche fornito una nuova visione della potenziale interazione tra i farmaci all’interno della miscela, suggerendo l’importanza di studiare gli effetti combinati di diverse classi terapeutiche al fine di acquisire una maggiore comprensione del loro impatto sugli organismi non-target.