IMPATTO ECOTOSSICOLOGICO DI FARMACI AD USO UMANO SULLA SPECIE MODELLO MYTILUS GALLOPROVINCIALIS: IL CASO STUDIO DI GEMFIBROZIL, METFORMINA E ROSIGLITAZONE.

Pharmaceuticals have become a significant threat for aquatic environments due to their widespread use and persistence. Since drugs are designed to be effective at very low concentrations, they have the potential to interfere with the biochemical and physiological processes of aquatic species. The aim of this thesis was to assess the ecotoxicological impact of the lipid-regulating agent gemfibrozil (GEM) and the antidiabetics metformin (MET) and rosiglitazone (ROS) on the bivalve Mitylus galloprovincialis. In vivo experiments were conducted by exposing mussels to single drugs at 2.5 g/concentration for 14 days to final investigate the onset of sub-lethal effects on immune functions, genotoxicity, neurotoxicity, oxidative stress and lipid metabolism. In addition, an ex vivo approach was applied on Precision-Cut Tissue Slices of digestive gland (PCTS). PTCS were treated with higher drug doses (500-1000 g/L) for 48h and 72h to stimulate clearer physiological responses, enabling a deeper investigation of the pharmaceutical’s impact on lipid and oxidative metabolisms. Results obtained from both experiments were integrated to provide a comprehensive overview on the mechanisms of action (MOAs) and the main metabolic pathways modulated by these drugs in non-target organisms. Obtained results revealed that all pharmaceuticals modulated the immune system, while no genotoxic and neurotoxic effects were observed. Furthermore, GEM, MET and ROS influenced the oxidative status and the lipid metabolism of mussels. Specifically, mussels treated with GEM and ROS showed overall similar responses: the ex vivo approach confirmed the hypolipidemic proprieties of these drugs also in non-target species at high exposure doses (500–1000 μg/L), while in vivo tests suggest that at lower concentrations (2.5 μg/L) the pronounced oxidative imbalance could be the cause of the higher level of neutral lipids. Similarly, the enhanced neutral lipids content detected under ex vivo conditions (500–1000 μg/L) following MET exposure appear to be associated with marked pro-oxidant effects rather than a stimulation of lipid synthesis. In conclusion, results obtained integrating in vivo and ex vivo tests allowed to increase our knowledge of the main metabolic pathways affected by the selected drugs in non-target organisms. Overall, the PCTS technique demonstrated to be a useful tool for elucidating the MOAs of pharmaceuticals, providing valuable insights into their environmental risk assessment.

I prodotti farmaceutici sono diventati una significativa minaccia per gli ambienti acquatici a causa del loro massiccio utilizzo e della loro presenza ubiquitaria negli ecosistemi aquatici. Poiché tali molecole sono progettate per essere efficaci a dosi molto basse, hanno il potenziale per interferire con i processi biochimici e fisiologici delle specie acquatiche. L'obiettivo di questa tesi è stato quello di valutare l'impatto ecotossicologico del regolatore lipidico gemfibrozil (GEM) e degli antidiabetici metformina (MET) e rosiglitazone (ROS) sul mitilo Mediterraneo Mytilus galloprovincialis. Gli esperimenti in vivo sono stati condotti esponendo gli organismi a singoli farmaci alla concentrazione di 2,5 µg/L per 14 giorni, al termine dei quali sono stati investigati un ampio numero di biomarkers biochimici e cellulari che comprendono le risposte immunitarie, effetti genotossici, neurotossici e la modulazione del metabolismo ossidativo e lipidico. Inoltre, è stato applicato un approccio ex vivo utilizzando sezioni di tessuto di ghiandola digestiva (PCTS) di mitilo, in cui i tre farmaci sono stati testati a dosi maggiori (500-1000 µg/L) per 48 e 72 ore al fine di stimolare risposte fisiologiche più evidenti, tramite l’analisi di parametri legati al metabolismo lipidico ed ossidativo. I risultati ottenuti da entrambi gli approcci sperimentali sono stati integrati per fornire delle indicazioni sui potenziali meccanismi d'azione (MOA) e vie metaboliche modulate da questi farmaci in organismi non target. I risultati hanno rivelato l’attivazione da parte di tutti i farmaci del sistema immunitario e limitati effetti geno e neurotossici. Inoltre, GEM, MET e ROS hanno modulato il sistema ossidativo e il metabolismo lipidico. Nello specifico, i mitili trattati con GEM e ROS hanno mostrato risposte complessivamente simili: l'approccio ex vivo sembrerebbe confermare le proprietà ipolipidemiche di questi farmaci anche in specie non target quando dosati alle concentrazioni (non terapeutiche) di 500-1000 µg/L, mentre i test in vivo hanno suggerito un’alterazione dell’omeostasi ossidativa alla concentrazione ambientalmente realistica di 2,5 µg/L. Tale effetto potrebbe rappresentare la causa dell’incremento di lipidi neutri. Analogamente, l’aumento del contenuto di lipidi neutri rilevato in condizioni ex vivo (500-1000 µg/L) a seguito dell'esposizione a MET sembra essere associato a marcati effetti pro-ossidanti piuttosto che a una diretta stimolazione della sintesi lipidica. In conclusione, i risultati ottenuti integrando test in vivo ed ex vivo hanno permesso di incrementare le nostre conoscenze sui principali percorsi metabolici influenzati dai farmaci selezionati in organismi non target. Inoltre, la tecnica PCTS si è dimostrata uno strumento utile per chiarire i meccanismi d'azione dei farmaci testati, fornendo intuizioni utili per la valutazione del loro rischio ambientale.