Un approccio microbiome-based per il biorisanamento di sedimenti marini altamente contaminati

Marine ecosystems play a crucial role for humans, providing natural resources, coastal protection, climate regulation, and economic benefits related to fishing and tourism. However, the intensification of human activities and the accumulation of chemical contaminants, such as hydrocarbons and heavy metals, compromise their integrity, calling for urgent need of effective and eco-sustainable remediation strategies. In this context, bioremediation based on the use of microorganisms capable of degrading and/or detoxifying environmental contaminants is gaining increasing interest as a cost-effective and eco-friendly solution. In this thesis, highly contaminated sediment samples from Bagnoli (obtained from surface and subsurface layers) were incubated in appropriate culture media with the addition of specific polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and heavy metals to promote the selection of the native microbiome and enrich microbial strains capable of degrading PAHs and resisting high concentrations of toxic metals. The obtained microbiomes were extracted, maintained in culture, and used in bioaugmentation tests, where they were added to contaminated sediments (from the same Bagnoli area) for bioremediation purposes. These tests were conducted by applying microbiomes individually (each microbiome obtained from a single sediment sample) or as a pool (combining different microbiomes from various sediment samples). The results showed a strong PAH degradation capability by the applied microbiomes, with higher yield when using pooled microbiomes (>70% PAH degradation in six months), suggesting a synergistic microbial degradation activity. The most effective microbiome pool was then subjected to DNA extraction and characterized taxonomically and functionally by shotgun DNA sequencing, leading to the reconstruction of 12 bacterial genomes (average genome completeness: 91%; range: 66-100%), some of which were affiliated with taxa already known for their petroleum hydrocarbon degradation capabilities (Alcanivorax, Halomonas, Georgenia, Marinobacter, Brevundimonas, Sphingomonas, Stenotrophomonas). Preliminary genome analysis helped unveil the genetic basis of these microbiomes' bioremediation potential by identifying several genes associated with hydrocarbon degradation and metal resistance/detoxification activities. Finally, cryopreservation tests were successfully conducted to assess the possibility of reactivating microbiomes after prolonged freezing. The microbiomes were successfully reactivated after five months of cryopreservation and subsequently applied again to contaminated sediments, continuing to exhibit high PAH degradation yields, comparable to those obtained with fresh microbiomes. This suggests the potential for a dynamic use of the obtained microbiomes in future bioremediation applications for sediments contaminated with hydrocarbons and heavy metals.

Gli ecosistemi marini rivestono un ruolo fondamentale per l’uomo, fornendo risorse naturali, protezione costiera, regolazione climatica e opportunità economiche legate alla pesca e al turismo. Tuttavia, l’intensificarsi delle attività antropiche e l’accumulo di contaminanti chimici, come idrocarburi e metalli pesanti, ne compromettono l’integrità, rendendo urgente la necessità di strategie di bonifica efficaci e sostenibili. In questo contesto, la bioremediation basata sull’utilizzo di microrganismi in grado di degradare e/o detossificare i contaminanti ambientali sta suscitando crescente interesse come soluzione economicamente vantaggiosa ed ecosostenibile. Nel presente lavoro di tesi, alcuni campioni di sedimenti di Bagnoli altamente contaminati (ottenuti da strati superficiali e sub-superficiali) sono stati incubati in appropriati terreni di coltura con aggiunte di specifici idrocarburi policiclici aromatici (IPA) e metalli pesanti, allo scopo di favorire una selezione del microbioma autoctono ed accrescere ceppi microbici in grado di degradare IPA e resistere ad alte concentrazioni di metalli tossici. I microbiomi ottenuti sono stati estratti, mantenuti in coltura, ed utilizzati in test di bioaugmentation, ovvero aggiunti a sedimenti contaminati (sempre dell’area di Bagnoli), allo scopo di biorisanarli. Tali test sono stati effettuati testando i microbiomi in singolo (ovvero ciascun microbioma ottenuto da ciascun campione di sedimento) oppure in pool (ovvero dopo unione dei diversi microbiomi ottenuti dai diversi campioni di sedimento). I risultati hanno mostrato una buona capacità di degradazione degli IPA da parte dei microbiomi utilizzati, con risultati migliori in caso di trattamento tramite pool di microbiomi (>70% di degradazione degli IPA in 6 mesi), suggerendo un’attività degradativa microbica di tipo sinergico. Il pool di microbiomi risultato più performante è stato poi sottoposto ad estrazione del DNA e caratterizzato dal punto di vista tassonomico e funzionale tramite DNA shotgun (sequenziamento massivo del DNA), permettendo di ricostruire 12 genomi batterici (completezza media del genoma: 91%; range, 66-100%) di cui vari affiliati a taxa già noti per le loro capacità di degradazione di idrocarburi del petrolio (Alcanivorax, Halomonas, Georgenia, Marinobacter, Brevundimonas, Sphingomonas, Stenotrophomonas). L’analisi preliminare dei genomi ha permesso di cominciare a svelare le basi genetiche del potenziale di tali microbiomi per il biorisanamento, identificando svariati geni riconducibili ad attività di degradazione di idrocarburi e resistenza/detossificazione di metalli. Sono stati infine allestiti con successo test di criopreservazione per verificare la possibilità di riattivare i microbiomi in seguito a congelamento prolungato. I microbiomi sono stati riattivati con successo dopo 5 mesi di criopreservazione e sono stati quindi aggiunti a sedimenti contaminati come fatto in precedenza, ed hanno continuato a mostrare buone rese di degradazione degli IPA, non dissimili dai trattamenti con microbiomi freschi, suggerendo la possibilità di un loro utilizzo dinamico per future applicazioni di bioremediation su sedimenti contaminati da idrocarburi e metalli.