Espressione ricombinante, produzione su larga scala e attività enzimatica della proteasi principale di SARS-CoV-2.

This thesis concerns the development and fine-tuning of a recombinant protein expression of the SARS-CoV-2 main protease Mpro. Producing the necessary quantities of Mpro useful to be able to carry out the structural analysis using SAXS techniques and to measure the enzymatic activity of the recombinant protein, investigating the inhibition potential of the selected small molecules, the results are varied. First of all, the microbial platform used for the production of recombinant Mpro was Escherichia coli, but two strains, BL21 (DE3) pLys and RosettaTM (DE3) were tested, obtaining a consistent amount of Mpro in solution is obtained using in particular strain BL21 (DE3) pLys. Furthermore, as a second result, different protocols have been applied for the purification of the main protease of SARS-CoV-2 by affinity chromatography, reaching the selection of the best conditions that guarantee stability, purity and activity. As a third result it can be seen that the choice of the best protocols for large scale production and purification of Mpro led to an optimal yield of 3-4 mg of protein per liter of battery culture. ​

Questa tesi riguarda lo sviluppo e la messa a punto di un protocollo di espressione proteica ricombinante della proteasi principale Mpro di SARS-CoV-2. Producendo le quantità necessarie di Mpro utili per poter effettuare l'analisi strutturale mediante tecniche SAXS e per misurare l’attività enzimatica della proteina ricombinante, investigando il potenziale di inibizione delle piccole molecole selezionate, vari sono i risultati ottenuti. Prima di tutto, la piattaforma microbica utilizzata per la produzione di Mpro ricombinante è stata Escherichia coli, ma sono stati testati due ceppi, BL21(DE3)pLys e RosettaTM(DE3), arrivando a concludere che quantità consistenti di Mpro in soluzione sono ottenuta utilizzando in particolare il ceppo BL21(DE3)pLys. Inoltre, come secondo risultato, sono stati applicati diversi protocolli per la purificazione della proteasi principale del SARS-CoV-2 mediante cromatografia di affinità, arrivando a selezionare le migliori condizioni che garantiscono stabilità, purezza e attività. Come terzo risultato si può osservare che la scelta dei migliori protocolli per la produzione e la purificazione di Mpro su ampia scala ha portato ad una resa ottimale di 3-4 mg di proteina per litro di coltura batterica. ​